Wie man monoklonale Zelllinien für das Stammzell-Engineering entwickelt
Die Sicherstellung der Monoklonalität ist bei der Entwicklung von Zelllinien zur Herstellung von Therapeutika, wie monoklonalen Antikörpern oder zellbasierten Therapien, unbestreitbar entscheidend. Um eine Zelllinie für die therapeutische Verwendung zu nutzen, muss ein Forscher nachweisen, dass die Zellen in einer Kolonie aus einer einzigen Zelle stammen. Das bloße Visualisieren von Kolonien in Plattenvertiefungen oder die Verwendung eines Konfidenzniveaus der Monoklonalität stellt keinen ausreichenden Nachweis der Monoklonalität dar, wenn es keine eindeutige Möglichkeit gibt, das Koloniewachstum aus einer einzigen Zelle nachzuverfolgen. Was können Sie noch tun, um monoklonale Zelllinien herzustellen und deren Monoklonalität zu validieren?
Die CloneSelect ®-Lösungen von Molecular Devices stellen dringend benötigte Workflow-Technologien für die Entwicklung monoklonaler Zelllinien dar. Vor kurzem haben wir mit Gargi Roy, einem Wissenschaftler im Department of Biopharmaceutical Development bei AstraZeneca, über die aktuellen Herausforderungen und Möglichkeiten zur Verbesserung der Entwicklung von Stammzelllinien gesprochen.
Zuvor verwendeten Roy und ihr Forschungsteam den ClonePix ® FL, um therapeutische monoklonale Antikörper aus Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zellen zu produzieren [1]. Als sie ihren Fokus auf das Stammzellen-Engineering verlagerten, wurde deutlich, dass die beiden Arbeitsabläufe trotz des gemeinsamen Gewindes der Herstellung monoklonaler Antikörper Unterschiede aufwiesen.
Das Stammzelltherapie-Team von AstraZeneca nutzt unsere CloneSelect-Produkte für das Stammzell-Engineering und die Entwicklung monoklonaler Zellen. Darüber hinaus erläuterte Roy, wie ihr Team monoklonale Zelllinien mit höherer Genauigkeit mithilfe der Klon-Screening-Lösungen von Molecular Devices anbaut. Dieser Artikel deckt auch Folgendes ab:
Überblick über das Stammzellen-Engineering
Das Stammzellen-Engineering umfasst die Umwandlung somatischer Zellen – jeder biologischen Zelle außer Spermien und Eizellen – oder embryonaler Zellen in Stammzellen, die in der Lage sind, sich in alle Zelltypen zu differenzieren. Dieser Ansatz zielt darauf ab, verschiedene Zellmodelle für die Krankheitsmodellierung, personalisierte Medizin, Wirkstoffforschung und Stammzell-basierte Therapeutika wie monoklonale Antikörper zu entwickeln.
Die beiden wichtigsten Ansätze des Stammzellen-Engineering sind:
- Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs): Sie werden durch die Einführung von Transkriptionsfaktoren aus somatischen Zellen umgewandelt.
- Embryonale Stammzellen (ESCs): Aus undifferenzierten embryonalen inneren Massenzellen gewonnen.
Beide Stammzelltypen haben gemeinsam, dass Sie sie zur Herstellung monoklonaler Antikörper bewegen können. Darüber hinaus weisen Stammzell-vermittelte monoklonale Antikörper bestimmte Vorteile gegenüber rekombinanten monoklonalen Antikörpern auf, wie z. B. eine bessere Penetration in den erkrankten Bereich und eine höhere Blut-Hirn-Schranke (BBB)-Querrate. [2].
Einzelzellisolierung mit dem CloneSelect Single-Cell Printer
Die erste Frage, die man sich stellen könnte, ist, was unsere CloneSelect Workflow-Lösungen bei der Herstellung monoklonaler Zelllinien und der anschließenden Beurteilung der Monoklonalität hervorhebt? Stellen Sie sich vor, Sie könnten eine einzelne Zelle gleichzeitig in ein Well abscheiden und die Monoklonalität mit einem visuellen Nachweis zum Zeitpunkt der Sortierung sicherstellen.
Die CloneSelect Single-Cell Printer Serie gewährleistet eine nahtlose Einzelzellisolierung und fördert durch ihre schonende Zellabgabe das maximale Auswachsen der Klone, während gleichzeitig die Möglichkeit einer Kreuzkontamination mit anderen Zelllinien ausgeschlossen wird. Sein Funktionsprinzip liegt in seiner mikrofluidischen Technologie, die einzelne Zellen sanft in flüssige Tröpfchen einkapselt und sie in ein Well einsät. Darüber hinaus erfasst sie fünf Bilder pro abgegebener Zelle und bietet einen bildbasierten Nachweis der Einzelzellisolierung und -ablagerung zum Zeitpunkt der Sortierung.
Für ein solches kompliziertes System ist der CloneSelect Single-Cell Printer mit unserer firmeneigenen Software einfach zu bedienen. Sobald Ihr Labor eine kurze Schulung mit unserem Team von Außendienst-Anwendungswissenschaftlern absolviert hat, werden Sie sofort von seinem benutzerfreundlichen und zellfreundlichen Design profitieren. Der Begriff „zellfreundlich“ bezieht sich auf zwei Dinge:
- Abwesenheit von Hochenergielasern (Zellfreundlichkeit wird durch sanfte, mit Schwerkraft versorgte Mikrofluidik erreicht)
- Kleine Dispensiervolumina (kein Abfall und keine Kontamination von Probe zu Probe)
Am wichtigsten ist vielleicht, dass die Aufnahme von qualitativ hochwertigen Zellbildern durch den CloneSelect Single-Cell Printer von seinen Ausschlusskriterien abhängig ist, die auf Zellform, Größe und Achsenverhältnis basieren. Durch die Ausschlusskriterien können Sie sowohl Elternzellen als auch veränderte Zellen mit den gewünschten Eigenschaften klonen.
Herstellung monoklonaler Zelllinien: Der allgemeine Arbeitsablauf
Ob Sie mit iPSCs, ESCs oder vielen anderen Zelltypen arbeiten, der unten zusammengefasste Arbeitsablauf bildet die Grundlage für die Produktion monoklonaler Zelllinien:
- Einzelzellendruck: Isolieren Sie eine einzelne Zelle, um eine Kolonie zu beginnen
- Zellexpansion und -charakterisierung: Bilden Sie Kolonien, bewerten Sie die Monoklonalität und stellen Sie sicher, dass Ihre Zellen die Proteine von Interesse exprimieren, indem Sie genotypische/Phänotyp-Assays durchführen
- Klonale Zelllinien: Zelltyp-spezifische Differenzierung
Ein einfacher Arbeitsablauf, der mit jeder Zellpopulation beginnt, einschließlich Ihrer Elternzelle, und verwendet wird, um etwas herauszuklonen oder eine veränderte Zelle, um Zellen zu einer gewünschten Eigenschaft zu machen.
Herausforderungen bei der Isolierung von Einzelzellen und dem Auswachsen von Klonalzellen
Selbst mit hochmodernen Einzelzell-Isolierungstechnologien und Monoklonalitäts-Arbeitsabläufen sind einige Herausforderungen immer noch möglich.
Laut Gargi Roy stellte sich die größte Herausforderung für ihr Team, als sie Zellen auf mehreren Platten ausdrucken und mehrere Kolonien mit denselben Eigenschaften bilden wollten. Mit zunehmender Anzahl an Einzelzellisolierungen wird häufig ein stetiger Rückgang der Effizienz des klonalen Auswuchses beobachtet. Der Rückgang ist noch deutlicher, wenn Sie Bedingungen ohne tierische Komponenten (ACF) implementieren wollen, die Sie berücksichtigen müssen, wenn tierische Forschung für Ihre Einrichtung von entscheidender Bedeutung ist.
Die Diskrepanzen in der Effizienz des klonalen Auswuchses sind bei ESCs deutlicher als bei iPSCs. Die Effizienz sinkt mit technisch optimierten ESCs auf einstellige Werte. Der Hauptgrund für den Rückgang ist der Rückgang der Zellviabilität während des Plattierens, sagt Roy. Sie betont auch die Verbesserung des experimentellen Designs durch Anreicherung des Mediums, insbesondere unter ACF-Bedingungen.
Die Unterschiede in der Effizienz des Kolonieauswuchses bei Einzelzellen zwischen IPSCs und ESCs zeigen signifikante Diskrepanzen bei ESCs.
Selbst wenn ausreichend klonales Auswachsen vorliegt, müssen Sie sehr vorsichtig sein, um eine Apoptose zu verhindern. Eine zeitgerechte Ernte von 8bis10 Tagen ist von grundlegender Bedeutung. Es wäre hilfreich, Ihre Kolonie täglich zu ernähren, um Hunger zu vermeiden.
Die Aggregation der Zellen ist ein weiteres Problem, das die Evaluierung der Monoklonalität behindert. Sie müssen das richtige Dissoziationsreagenz verwenden, um Zellen von der Well-Oberfläche und voneinander zu trennen, was ein wichtiger Schritt für die Downstream-Analyse ist.
Probleme bei der Sicherstellung während der Entwicklung monoklonaler Zelllinien
Die Verifizierung der Monoklonalität ist für die Entwicklung von Zelllinien von entscheidender Bedeutung. Sie müssen einen detaillierten Nachweis dafür erbringen, dass Ihre Zellpopulation von einer einzigen Zelle für die Zulassung gewonnen wird. Roys Team fand ESCs aufgrund ihrer Klebefläche und unregelmäßigen Formen besonders schwer zu überwachen. Wenn zwei ESCs in unmittelbarer Nähe verteilt würden, würden sie wahrscheinlich als eine einzelne Zelle detektiert werden. Wenn Sie mit einer knappen Frist konfrontiert sind, können Sie auch eine limitierende Verdünnung für Statistiken anwenden, um die Wahrscheinlichkeit einer Monoklonalität zu berechnen.
Der CloneSelect Single-Cell Printer verfügt über fortschrittliche Imaging-Techniken, um die Monoklonalität zum Zeitpunkt der Einzelzellisolierung nachzuweisen. Der Drucker kann während der Zellabscheidung nicht nur leicht zwischen zwei sehr nahen Zellen unterscheiden, sondern ermöglicht es Ihnen auch, Ihre Kolonie vom Tag der Ernte bis zum Tag zurückzuverfolgen0, um die Monoklonalität zu gewährleisten, wie in der Abbildung unten dargestellt.
Bestätigung der Monoklonalität und Aufnahme von Einzelzellbildern mit dem CloneSelect Single-Cell Printer
Klonale Charakterisierung
Die abschließende Komponente der Zelllinienentwicklung ist die Charakterisierung. Sobald die Monoklonalität beurteilt wurde, stellen Sie sicher, dass diese Monoklonalität im Genotyp und in der Pluripotenz reflektiert wird. Haben die Zellen in Ihrer Kolonie alle konstante Werte der gewünschten Funktionalität? Noch wichtiger ist, dass sie genomisch stabil sind, was bedeutet, dass sie genetisches Material von einer Generation zur nächsten konservieren und übertragen können? Sind sie schließlich pluripotent (d. h. können sie sich in drei Hauptkeimschichten differenzieren – Ektoderm, Endoderm und Mesoderm)? Die Antworten können nur durch das Hochdurchsatz-Screening von Klonen erzielt werden.
Hier kann der CloneSelect Imager durch zusätzliches Vertrauen in die Sicherstellung der Monoklonalität einen Mehrwert für Ihre Forschung schaffen. Der CloneSelect Imager enthält labelfreie Hellfeldtechnologie mit anpassbarem Fluoreszenz-Imaging, begleitet von fortschrittlichen Datenanalysewerkzeugen, einschließlich Konfluenzmessungen, Wachstumskurven, Erstellung von Monoklonalitätsberichten und Plattenminiaturansichten, um das Auswachsen von Kolonien in jedem Well schnell zu visualisieren.
Dank der hohen Auflösung und der Vielzahl an Imaging-Modi können Sie sogar die für die Zellen in Ihrem Klon spezifischen Zellmarker detektieren. So können Sie bestätigen, ob Ihre monoklonalen Zelllinien die gewünschte Funktionalität haben.
Die folgende Abbildung zeigt die Differenzierung monoklonaler ESCs in drei verschiedene Keimschichten, die die jeweiligen Biomarker in jeder Schicht enthalten.
Qualitativ hochwertige/stabile Zellen mit unserem Einzelzelldrucker, wodurch die Differenzierung in drei Keimschichten vereinfacht wird: endoderm, mesoderm und ectoderm.
Der Umfang der funktionellen Beurteilung des CloneSelect Imagers wird auch nach Beginn der Zelldifferenzierungsphase fortgesetzt. Durch Fluoreszenz-Imaging können Sie Zellen überwachen, während sie sich differenzieren, um verschiedene Gewebeschichten zu bilden.
Wie kann ich mehr über monoklonale Zelllinien erfahren?
Von der anfänglichen Ausplattierungsphase bis zum Auswuchs und der Zelldifferenzierung ist die Entwicklung monoklonaler Zelllinien einfacher, indem unser CloneSelect-Arbeitsablauf für die monoklonale Sicherheit genutzt wird.
Weitere Informationen zum Arbeitsablauf der Monoklonalitätssicherung des CloneSelect Single-Cell Printer und des CloneSelect Imagers finden Sie in der Forschung des AstraZeneca Stammzellenteams. Im kürzlichen Webinar von Molecular Devices stellt Gargi Roy die Herausforderungen und Lösungen in der Sicherstellung der Monoklonalität vor. Ihre Forschungsergebnisse zeigen, wie man monoklonale Zelllinien entwickelt und die Zellen in Ihrer Kolonie evaluiert.
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Nehmen Sie an dem On-Demand-Webinar, Monoklonalitätssicherung mit dem CloneSelect Single-Cell Printer und dem CloneSelect Imager in Human Stem Cell (hSC) Engineering Workflow, mit Dr. Roy teil.
- Roy, Gargi, et al. „Das sequenzielle Screening durch ClonePix FL und die intrazelluläre Färbung erleichtern die Isolierung von High-Producer-Zelllinien für die Herstellung monoklonaler Antikörper.“ Journal of Immunological Methods 451 ( 2017): 100-110.Roy, Gargi, et al. „Sequenzielles Screening durch ClonePix FL und intrazelluläre Färbung erleichtern die Isolierung von High-Producer-Zelllinien für die Herstellung monoklonaler Antikörper.“ Journal of immunoological methods 451 (2017): 100-110.
- Frank, Richard T et al. „Kurze Prüfung: Stammzellen als neue Plattform für die Antikörpertherapie von Krebs.“ Stammzellen (Dayton, Ohio) Vol. 28,11 ( 2010): 2084-7. doi:10.1002/stem.513.Frank, Richard T et al. „Konkrete Prüfung: Stammzellen als neue Plattform für die Antikörpertherapie von Krebs.“ Stammzellen (Dayton, Ohio) Vol. 28,11 (2010): 2084-7. doi:10.1002/stem.513.