Was ist Fluoreszenz?

Fluoreszenz bezeichnet die Fähigkeit mancher Atome und Moleküle, Licht bei einer bestimmten Wellenlänge (der Anregung: Ex, excitation) zu absorbieren und anschließend bei einer kurzlebigen Emission (Em) von Licht einer längeren Wellenlänge wieder abzugeben (Abbildung 2). Die Distanz zwischen den Anregungs- und Emissions-Peaks wird als Stokes-Verschiebung bezeichnet und ist abhängig vom Fluorophor (Abbildung 1).

Fluoreszenz erfordert eine externe Lichtquelle, um die Probe bei einer bestimmten Wellenlänge anzuregen. Wenn es bei der richtigen Wellenlänge angeregt wurde, wird das Molekül von einem Grundzustand in einen angeregten Zustand umgewandelt. Wenn das Molekül in den Grundzustand zurückfällt, wird die Energie in Form von Hitze (Energieverlust) und Licht bei einer längeren Wellenlänge geringerer Energie abgegeben (Abbildung 3).

 

Stokes-Verschiebung und Fluorophor-Abhängigkeit

 

Abbildung 1

Anregung und kurzlebige Emission

 

Abbildung 2

Wellenlänge der niedrigeren Energie

 

Abbildung 3

Wie funktioniert die Fluoreszenzdetektion?

Ein Mikroplatten-Reader mit Fluoreszenzintensitäts (FI)-Detektion nutzt eine Lichtquelle, üblicherweise eine Xenon-Blitzlampe  oder LED, um ein Fluorophor (Fluoreszenzmolekül) bei einer bestimmten Wellenlänge anzuregen. Die für die Anregung der Probe erforderliche Wellenlänge kann entweder durch einen Filter einer bestimmten Wellenlänge oder einen Monochromator, der auf die erforderliche Wellenlänge eingestellt ist, isoliert werden.

Das Fluorophor emittiert dann Licht einer anderen Wellenlänge, das durch einen zweiten Filter oder Monochromator isoliert wird. Diese emittierte Fluoreszenz wird durch eine Photomultiplier-Röhre (PMT, photomultiplier tube) detektiert, und die Fluoreszenzintensität der Probe wird als relative Fluoreszenz ausgegeben.

 

  • Fluorometer vs. Spektrofluorometer vs. Fluoreszenz-basierter Platten-Reader

    Fluorometer vs. Spektrofluorometer

    Es gibt viele Begriffe, die ein Instrument bezeichnen, das die Fluoreszenz einer Probe misst: Fluorometer, Spektrofluorometer, Fluoreszenz-Spektrophotometer, Fluoreszenz-Spektrometer, Fluorimeter, usw. 

    Im Allgemeinen nutzen diese eine Lichtquelle, um die Probe bei einer bestimmten Wellenlänge anzuregen, und messen die emittierte Fluoreszenz bei einer zweiten Wellenlänge. Die Probe kann in vielen Gefäßformaten vorliegen, darunter Küvetten, Kapillaren und Petrischalen. Der Begriff „Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader“ bezeichnet ein Instrument, das die Fluoreszenz einer Probe in einer Mikroplatte messen kann, meistens eine 96- oder 384-Well-Platte. Mikroplatten bieten einen hohen Durchsatz und sind nützlich, wenn in Screenings oder Anwendungen viele Proben analysiert werden müssen.

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    Was ist ein Spektrofluorometer-System mit Dual-Monochromator?

    Was ist ein Spektrofluorometer-System mit Dual-Monochromator

    Manche Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader verwenden Dual-Monochromatoren anstatt Filter, um die Wellenlänge des Lichts zu isolieren, das die Probe anregt, ebenso wie zur Isolation der Wellenlänge des Lichts, das von der Probe emittiert wird. Monochromatoren nutzen ein Beugungsgitter, um die Farben des Lichts räumlich zu trennen. Sie können ein breites Spektrum an Wellenlängen isolieren, ohne dass die Installation eines separater Filters für jede in einer Anwendung benötigte Wellenlänge erforderlich ist.

    Unsere SpectraMax Gemini Spektrofluorometer mit Dual-Monochromator nutzen zwei Scan-Monochromatoren zur Isolation der optimalen Anregungs- und Emissions-Wellenlängen.

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  • Calcium-Assays (GPCR)

    Calcium-Assays (GPCR)

    Von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) übermittelte Zellsignale können durch eine Überwachung der Downstream-Effektoren Calcium oder zyklisches AMP (cAMP, cyclic AMP) untersucht werden. Der Calcium-Flux als Reaktion auf die Aktivierung des Gq-Protein-gekoppelten Rezeptors wird in Lebendzellen üblicherweise in Echtzeit überwacht. Verwendet wird hierfür ein Calcium-sensitiver Farbstoffe und ein Fluoreszenz-Platten-Reader.

    Hier sind ein paar Application Notes über Calcium-Assays (GPCR), die Sie vielleicht interessant finden:

    cAMP-Assays (GPCR)

    cAMP-Assays (GPCR)

    Die Überwachung von cAMP, einem Botenstoff, der als Reaktion auf die Aktivierung der Adenylatcyclase produziert wird, ist einer der häufigsten Wege, um auf Antagonisten und Antagonisten der Gi- / Gs-gekoppelten Rezeptoren zu screenen. cAMP-Konzentrationen können mithilfe von Fluoreszenzmolekülen überwacht werden, die an cAMP binden und mit einem Fluoreszenz-Platten-Reader detektiert werden.

    Hier sind einige Application Notes über cAMP-Assays (GPCR), die Sie vielleicht interessant finden:

  • Caspase-3 Apoptose-Assays

    Caspase-3 Apoptose-Assays

    Die Apoptose ist ein stark reguliertes zelluläres Programm, dass den Zelltod verursacht – in normalen Prozessen, wie der embryonalen Entwicklung, ebenso wie in Erkrankungen, einschließlich Krebs, und neurodegenerativen Zuständen. Apoptose-Assays können mit einer Vielfalt an Imaging- oder Mikroplatten-Reader-Detektionssystemen durchgeführt werden und liefern wertvolle Informationen über normale und krankheitsbedingte Mechanismen des Zelltods.

    Entdecken Sie einen homogenen Single-Step-Assay für Caspase-3, der speziell für Mikroplatten-Reader konzipiert ist:

    Zellproliferations-Assays

    Zellproliferations-Assays

    Die Quantifizierung der Zellproliferation mittels Fluoreszenz ermöglicht es, die Auswirkungen von Wirkstoffen und anderen experimentellen Behandlungen auf das Zellwachstum einfach zu überwachen.

    Diese Application Note beschreibt zwei Assaymethoden für die Zellproliferation. In der ersten wird die zelluläre Proliferation mithilfe einer zellbasierten Standardkurve quantifiziert. In der zweiten wird die zelluläre Proliferation quantifiziert, indem RNase-behandelte Zellproben und eine DNA-Standardkurve verwendet werden.

  • Zytotoxizitäts-Assay

    Zytotoxizitäts-Assay

    Die Entwicklung von voraussagekräftigen in vitro Assays, die zum Testen der Sicherheit und Wirksamkeit geeignet sind, ist für die Verbesserung der Wirkstoffentwicklungsprozesse und der Verringerung des Wirkstoffversagen von großer Bedeutung. Es besteht ein großes Interesse an der Nutzung von Stammzellen als Werkzeuge für das Screening von Verbindungen während der frühen Phasen der Wirkstoffentwicklung.

    In diesem wissenschaftlichen Poster präsentieren wir die Ergebnisse, die mit einem unserer Multi-Mode Platten-Reader erzeugt wurden. Dieser wurde eingesetzt, um die Toxizität vieler verschiedener Verbindungen in aus Stammzellen entwickelten Zellmodellen mittels eines Hochdurchsatzverfahrens zu bestimmen:

    EarlyTox Cardiotoxicity Assay

    EarlyTox Cardiotoxicity Assay

    Von Stammzellen abstammende humane Kardiomyozyten haben phänotypische Eigenschaften und elektrophysiologische Profile ähnlich denen von nativen humanen Herzzellen. Kultivierte Kardiomyozyten sind in der Lage, ein kontrahierendes Synzytium zu bilden, das sich ähnlich zu nativen Kardiomyozyten verhält. Die Oszillation der intrazellulären Calciumkonzentrationen, die bei synchronisierten Kontraktionen der Zellen auftreten, können mithilfe eines Calcium-sensitiven Farbstoffs beobachtet werden, und behandlungsbedingte Veränderungen des Fluoreszenzsignalmusters können über die Zeit beobachtet werden.

    Hier ist eine Application Note, die Sie vielleicht interessant finden:

  • EarlyTox Zellviabilitäts-Assay-Kits

    EarlyTox Zellviabilitäts-Assay-Kits

    Assays zur Bestimmung der Lebensfähigkeit von Zellen finden in vielen Forschungsgebieten Anwendung, von der Untersuchung der Mechanismen des Zelltods bis hin zur Entwicklung neuer Therapeutika gegen Apoptose bei Krankheiten.

    Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader gehören zu den gängigsten Technologien zur Detektion der Lebensfähigkeit von Zellen. Hier sind ein paar Application Notes, die Sie vielleicht interessant finden:

    Fluoreszente Proteinquantifizierung

    Fluoreszente Proteinquantifizierung

    Proteine liegen innerhalb eukaryoter Zellen in einem dynamischen Zustand vor, in einem stark regulierten Gleichgewicht zwischen Synthese und Abbau. Während nach jahrzehntelanger Erforschung ein gutes Verständnis der Proteinsynthese besteht, hat unser Wissen über den Abbau von Proteinen erst in den letzten zwei Jahrzehnten größere Fortschritte gemacht.

    Erfahren Sie in unserer Application Note mehr über fluoreszente Proteine:

  • Nanopartikel-Analyse

    Nanopartikel-Analyse

    Die Nanotechnologie ist ein sich schnell entwickelndes Feld, das in der wissenschaftlichen Gemeinschaft aufgrund ihrer möglichen Anwendungen in der biomedizinischen Forschung auf Interesse gestoßen ist.

    Derzeit ist lediglich eine begrenzte Anzahl an Techniken verfügbar, die zur Beschreibung von Nanopartikeln und deren molekularer Interaktionen dienen. Hier beschreiben wir die Spektralsignaturanalyse als eine Methode zur Bestätigung von Interaktionen zwischen Nanopartikeln und Molekülen in Oberflächenbeschichtungen.

    Neuronaler Calcium-Flux

    Neuronaler Calcium-Flux

    Die Überwachung von Veränderungen im intrazellulären Calcium ist eine sehr hilfreiche Technik bei der Untersuchung der vielfältigen Rollen, die Calciumionen in funktionierenden Neuronen übernehmen. Die direkte Messung des dynamischen Calcium-Flux innerhalb von neuronalen Netzwerken deckt auf, wie Nervenzellen Signale aus dem extrazellulären Umfeld verarbeiten.

    Diese Application Note beschreibt die Durchführbarkeit der Messung des intrazellulären Calcium-Flux in primären kortikalen Nervenzellen der Ratte in einem fluoreszenten Mikroplatten-Format:

  • Nukleinsäure-Quantifizierung

    Nukleinsäure-Quantifizierung

    Die Quantifizierung von DNA ist ein wichtiger Schritt in der Molekularbiologie, der Genauigkeit und Zuverlässigkeit verlangt und bei Anwendungen wie etwa Next-Generation Sequenzierung mit immer kleineren Probenvolumen durchgeführt wird. Verglichen mit der spektrophotometrischen DNA-Quantifizierung bietet die fluorometrische Methode entscheidende Vorteile, beispielsweise die deutlich höhere Empfindlichkeit, die hohe Selektivität für doppelsträngige DNA (dsDNA) gegenüber einzelsträngiger DNA (ssDNA) oder RNA und die höhere Unempfindlichkeit gegenüber Kontaminanten (Protein- und Kohlenhydratmoleküle).

    Hier sind ein paar Application Notes zur Nukleinsäurequantifizierung, die Sie vielleicht interessant finden:

    Tryptophannachweis

    Tryptophannachweis

    Die intrinsische Fluoreszenz von Proteinen entsteht durch die aromatischen Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin. Tryptophan, das bei 270 bis 280 nm maximal angeregt wird und in Wasser einen Emissionspeak nahe 350 nm aufweist, dominiert die Emission von Proteinen und ist gegenüber der Polarität zwischen Lösungsmitteln und der lokalen Umgebung am empfindlichsten.

    In diesen Application Notes demonstrieren wir die Leistungsfähigkeit der SpectraMax Multi-Mode Microplate Reader für Assays zur Messung der intrinsischen Tryptophan-Fluoreszenz.

Ressourcen zur Fluoreszenz

Zugehörige Produkte für die Fluoreszenz

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