Produktion von Organoiden im industriellen Maßstab: Herausforderungen, Vorteile und Lösungen
Die Erkenntnis, dass 2D-Zelllinien nicht die Komplexität aufweisen, um menschliche biologische Systeme darzustellen, ermutigte Wissenschaftler, fortschrittlichere In-vitro-Kulturwerkzeuge für die biomedizinische Forschung zu suchen. Die jüngsten Fortschritte haben zur Erstellung von 3D-Modellen wie Sphäroiden und Organoiden geführt.
Sphäroide sind im Allgemeinen frei schwebende Aggregate mehrerer Zelltypen und weisen wahrscheinlich eine geringe Komplexität bei der Spiegelung der Tumororganisation auf. Organoide hingegen werden durch ihre Fähigkeit definiert, sich von differenzierten Stammzellen in eine räumliche Anordnung zu integrieren, die das von ihnen repräsentierte Körperorgan widerspiegelt und die Struktur und biologische Funktion des Organs nachbildet, jedoch im kleinen Maßstab. Organoide sind somit ein physiologisch relevantes Modell für die Erforschung menschlicher Erkrankungen und die Beurteilung der Wirksamkeit und Sicherheit von Wirkstoffen – Organoide imitieren beispielsweise das Ansprechen des Patienten, wenn beide mit denselben Wirkstoffen behandelt werden. Organoide können produziert werden, die krankes oder gesundes Gewebe aus den meisten Organen im Körper darstellen.
Aus diesem Grund bieten organoide Zellmodelle die Möglichkeit, die Arzneimittelentwicklungspipeline zu beschleunigen und so die hohe Fluktuationsrate in klinischen Studien und die damit verbundenen Kosten zu reduzieren.
Damit dies jedoch weit verbreitet und mit Screening-Anwendungen mit hohem Durchsatz kompatibel wird, ist die Produktion von Organoiden im großen Maßstab erforderlich.
Skalierung der Produktion von Organoiden, um Konsistenz, Reproduzierbarkeit und statistische Relevanz zu gewährleisten, wenn Tests schwierig sind. In diesem Podcast diskutieren die Organoidexperten Victoria Marsh Durban, Director of Custom Organoid Services bei Molecular Devices, und Magdalena Kasendra, Director of Research and Development am Center for Stem Cell and Organoid Medicine am Cincinnati Children’s Hospital, die Vorteile und Herausforderungen der Produktion von Organoiden im industriellen Maßstab.
Grundlagen der Organoidproduktion
Organoide entstehen in der Regel aus pluripotenten oder adulten Stammzellen.
Pluripotente Stammzellen (PSCs) können aus Hautfibroblasten oder mononukleären Zellen des peripheren Blutes gewonnen werden. Sie sind selbsterneuernd und können neu programmiert werden, um sie in mehrere Zelltypen zu differenzieren. Bei der Verwendung von PSCs muss die embryonale Entwicklung in vitro in einem komplexen mehrstufigen Prozess rekapituliert werden, bei dem verschiedene Wachstumsfaktoren angewendet werden, um Merkmale mehrerer Zelllinien zu erzeugen. Dies führt zur Differenzierung in mehrere Organoidtypen (z. B. Gehirn, Lunge, Herz, Niere und Leber) von denselben ursprünglichen Zellen, daher der Begriff induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs).
Beispiele für 3D-Zellmodelle von oben links – Gehirnorganoide, Lungenorganoide, Kardioide (Herzorganoide) und 3D-Lebermodelle.
Adulte Stammzellen, aus Patientenbiopsieproben oder reseziertem Gewebe, verfügen über einen angeborenen zellulären Mechanismus, der sie dazu zwingt, den erforderlichen Weg zur Reproduktion des Gewebes, aus dem sie stammen, zu differenzieren. Mit anderen Worten, sie können sich spontan im Labor zu Organoiden formen, wenn sie in extrazellulären Matrizen kultiviert werden und geeignete gewebespezifische Wachstumsfaktoren erhalten.
Im Allgemeinen ist die Herstellung von Organoiden aus adulten Stammzellen, die aus primären Patientengewebebiopsien isoliert wurden, einfacher als die Verwendung von iPSCs.
Herausforderungen bei der Produktion von Organoiden
Die Organoid-Forschung ist immer noch neu und wächst, sodass Wissenschaftler mit Herausforderungen bei der Optimierung und der Scale-Up-Organoidproduktion konfrontiert werden, unabhängig vom Stammzelltyp, der als Ausgangspunkt verwendet wird.
Eine der Hauptherausforderungen bei der Verwendung von Organoiden, die aus adulten Stammzellen gewonnen werden, ist der Zellkultivierungsprozess, der vollständig in 3D mit Hydrogel durchgeführt werden muss. Dieser Prozess ist viel anspruchsvoller und zeitaufwendiger als die 2D-Kultur.
PSC-basierte Arbeitsabläufe bringen zusätzliche Komplikationen mit sich, da sie nur schwer in die gewünschten Differenzierungsmuster manipuliert werden können. Magdalena erklärt: „Bei der Verwendung von iPSCs müssen wir die embryonale Entwicklung in vitro durch die Einführung verschiedener Wachstumsfaktoren nachahmen, um verschiedene Zelllinien nachzuahmen.“ Glücklicherweise können diese Einschränkungen heute durch die Entwicklung hoch automatisierter, hochmoderner Bioprozesse überwunden werden.
Bioreaktoren werden häufig in der Kultivierung von Organoiden (sowohl iPSC als auch auf Stammzellen basierend) unter sorgfältig überwachten Umgebungsbedingungen verwendet. Insbesondere der Übergang vom anfänglichen Wachstum in Hydrogel-basierten Matrizen zur Suspension in Bioreaktoren erfordert große Sorgfalt.
Während iPSCs in einem Hydrogel suspendiert sind, werden sie keiner mechanischen Stimulation ausgesetzt. Die Platzierung in einer 3D-Suspension setzt sie jedoch einer sich schnell verändernden Scherbelastung aus, die sich auf die Wachstumsrate und Differenzierung auswirken kann. Während geringe Scherbelastungen die Differenzierung fördern, können übermäßige Konzentrationen zu Zellschäden und zum Tod führen. Daher muss die Scherspannung des Bioreaktors sorgfältig optimiert werden, um die gewünschten Differenzierungszustände zu erreichen, ohne die Ausbeute der Organoide zu verlieren. Die aktuellen Strategien umfassen die Regulierung der Rotationsgeschwindigkeit des Bioreaktors oder die Verwendung eines scherbelastungsfreien Bioreaktors. Die optimale Strategie hängt von den genauen Wachstums- und Differenzierungsanforderungen für das zu untersuchende Organoid ab und stellt sicher, dass das Hydrogel, das die ursprünglichen Stammzellen trägt, mit dem Bioreaktor kompatibel ist. So können beispielsweise weiche Hydrogele in Bioreaktoren aufgrund von Scherbelastung abgebaut werden, wodurch die Integrität der Stammzellaggregate gefährdet wird.
Eine weitere Herausforderung ist die Schwierigkeit, das Ausgangsmaterial für die adulten Stammzellen zu erhalten, d. h. eine geeignete ursprüngliche Organoidlinie oder primäres Patientenbiopsiematerial zu finden. Derzeit werden die meisten Organoid-Forschungen an akademischen Einrichtungen durchgeführt, wo Organoide ausschließlich für gemeinnützige Forschungszwecke produziert werden. Die Übersetzung von der akademischen in das kommerzielle Umfeld, wie z. B. pharmazeutische Unternehmen, wird jedoch unvermeidlich ethische Bedenken aufwerfen. Bei der Vermarktung von Organoid-Kulturen aus Patientenproben muss die ethische Einwilligung berücksichtigt werden.
Kolorektale Organoide können verwendet werden, um Krankheiten wie entzündliche Darmerkrankungen (CED) zu untersuchen.
Die Reproduktion von Organoidkulturen aus Originalorganoiden kann aufgrund der Unterschiede zwischen verschiedenen Zelllinien-Optimierungsprotokollen ebenfalls mühsam sein. Zum Beispiel umfasst die zerebrale (Hirn-)Organoidkultivierung die Übertragung von IPKS auf ein neuronales Induktionsmedium, bevor sie in Hydrogeltröpfchen gezüchtet werden. Victoria sagt: „Die Protokolle können je nach Quellgewebetyp erheblich variieren, z. B. ob es sich um ein Krebsgewebe handelt und zu welchem Krebstyp es gehört. Aus diesem Grund müssen Sie möglicherweise den Produktions-Arbeitsablauf von Zeile zu Zeile optimieren, was ein fachkundiges Auge erfordert.“
Ein einziger Fehler bei der Protokollimplementierung kann die Zelllinie dazu bringen, sich in einen unerwünschten Phänotyp zu differenzieren.
Vorteile der Aufskalierung von Organoiden
Auch wenn sich die Ausweitung der Organoidproduktion als schwierig erweisen kann, kann dies eine erhebliche Belohnung sein.
Einer der Hauptvorteile ist laut Magdalena die einfache Übersetzung in die biopharmazeutische Landschaft: „Durch die Vergrößerung sind Organoide für Industriestandards und regulatorische Praktiken zugänglich, sodass sie leichter in der Wirkstoffforschung, Stammzelltherapie und personalisierten medizinischen Anwendungen eingesetzt werden können.“
Die Chargenproduktion von Organoiden im großen Maßstab kann sowohl der akademischen als auch der industriellen Forschung zugutekommen. Die Herstellung großer Organoid-Chargen ermöglicht es Wissenschaftlern und Herstellern, größere Experimente mit Hochdurchsatz-Assays durchzuführen.
Victoria fügt hinzu, dass große Organoid-Chargen die Variabilität von Charge zu Charge verringern können: „Insbesondere tierische Reagenzien, die in der Produktion von Organoiden verwendet werden, stammen oft aus verschiedenen Quellen. Diese wachsenden Reagenzien werden speziell für kleine Experimente gewonnen. Das bedeutet, dass jedes Mal, wenn man Organoide anbauen möchte, ein anderes Reagenz verwendet wird, was auf eine fehlende Organoid-Standardisierung hindeutet.“
Und schließlich kann der Einsatz kompatibler Bioreaktoren Forschern dabei helfen, Umgebungsbedingungen wie Scherbelastung leichter zu überwachen und letztendlich die Konsistenz und damit die Reproduzierbarkeit zu verbessern.
Organoide: Die Vorhersagekraft von 3D
Der verstärkte Schwerpunkt der Organoidforschung liegt hauptsächlich darin, dass Organoide tiefere Einblicke in die Gewebearchitektur und Zell-Zell-Interaktionen gewinnen, was die Vorhersagekraft im Wirkstoffforschungsprozess erhöht. So wurden beispielsweise „Mini-Darm“ verwendet, um die wirksamsten Medikamente für Patienten mit spezifischen Formen der zystischen Fibrose zu identifizieren (1). Ähnliche Modelle, die von Patienten angebaut wurden, die an Magen-Darm-Krebs erkrankt waren, wiesen ebenfalls Vorhersagen über die Auswirkungen von Therapien auf die Patienten selbst auf (2). In jüngster Zeit wurde eine große Bandbreite an Organoidtypen verwendet, um die Auswirkungen einer SARS-CoV-2-Infektion in verschiedenen Geweben zu modellieren und verschiedene Therapien zu identifizieren (3).
Darm-Organoide sind 3D-Mikrogewebemodelle, die Strukturen des Darmlumens und des umgebenden Darmepithels nachbilden. Es kann wesentliche Funktionen des Darms wie die Nährstoffaufnahme und die Schleimsekretion simulieren.
Diese verbesserte Voraussagekraft bedeutet, dass Organoide das Versagen von Wirkstoffkandidaten bereits zu einem früheren Zeitpunkt in der Pipeline der Wirkstoffforschung erkennen und falsch positive Ergebnisse (d. h. Kandidaten, die trotz ihres Versprechens in der präklinischen Forschung im klinischen Umfeld versagt haben) viel früher im Prozess eliminieren können.
Organoide sind auch in der personalisierten Medizin vielversprechend. Patientenspezifische Stammzellen führen zu Organoiden, die mit der genetischen Zusammensetzung und den physiologischen Eigenschaften des Patienten übereinstimmen. Daher werden Organoide bei der Entwicklung maßgeschneiderter Therapien für Personen mit seltenen genetischen Erkrankungen und behandlungsresistenten Krebsarten von unschätzbarem Wert sein.
Eine breitere Verwendung von Organoiden kann auch die Verwendung von Tiermodellen reduzieren. Ähnlich wie bei 2D-Zellmodellen sind auch Tiermodelle bei der Vorhersage des Ansprechens der Patienten unzureichend, sodass ihre breite Verwendung ein Risiko für ein klinisches Versagen darstellt. Zudem besteht der zusätzliche Druck ethischer Bedenken in Bezug auf den Einsatz von Tieren in der Wirkstoffforschung. Mit der Einführung des FDA-Modernisierungsgesetzes haben Forscher begonnen, alternative Strategien für Tiermodelle zu suchen.
Die Verwendung von Organoiden als In-vitro-Plattform für die Arzneimittelentwicklung und die Erforschung von Krankheitsmechanismen zusammen mit Gesetzesänderungen wird es uns ermöglichen, die Anzahl der in der Forschung verwendeten Tiere zu reduzieren. Die Akzeptanz von Organoiden gewinnt an Zugkraft, da die Wissenschaftler ihren Wert erkennen und die notwendigen Fähigkeiten und Erfahrungen erwerben, um sie im Labor einzusetzen. Der Zugang zu Organoidlinien und die Entwicklung von Assays zur vollen Nutzung dieses komplexen, humanzentrischen In-vitro-Modells wird das Organoidfeld erheblich erweitern und uns in eine neue Ära der Life Science-Forschung führen.
- Saini, Angela. „Patienten mit Mukoviszidose profitieren von Mini-Darm.“ Zellstammzelle 19,4 (2016): 425–427.
- Vlachogiannis, Georgios, et al. „Von Patienten stammende Organoide modellieren das Ansprechen auf die Behandlung von metastasierenden gastrointestinalen Krebsarten.“ Wissenschaft 359,6378 ( 2018): 920–926.
- Han, Yuling, et al. „Modelle für menschliche Organoide zur Untersuchung der SARS-CoV-2-Infektion.“ Nature Methods 19,4 (2022): 418–428.