Aus Patienten gewonnene Organoide (PDOs oder nur „Organoide“) werden häufig im Zusammenhang mit der Wirkstoffforschung und der medizinischen Forschung erwähnt. Dieser Artikel erklärt, was PDOs sind und wie Wissenschaftler sie aus gespendetem Patientengewebe gewinnen und wachsen lassen. Diese 3D-Biologiemethoden sind relativ neu, und dieses Forschungsgebiet entwickelt sich schnell.

Erfahren Sie alles darüber, wie PDOs wachsen können, darunter:

Organoide sind mikroskopische 3D-Versionen der Organe, aus denen sie stammen. Zum Beispiel kann der „Darm“ aus gesundem oder erkranktem Biopsiegewebe aus dem Darm eines Patienten gewonnen werden. Wichtig ist, dass PDOs originalgetreue Replikate des Gewebes sind, aus dem sie stammen, einschließlich der verschiedenen Zelltypen und aller zugrunde liegenden Erkrankungen.

Das Bild zeigt ein kolorektales Krebsorganoid oder „Mini-Darm“. Die blaue Färbung zeigt die DNA in einzelnen Zellen und die gelbe Farbe zeigt die Räume innerhalb der Struktur, die der Darmhöhle entsprechen. Links wird ein vollständiger 3D-PDO angezeigt, rechts sehen Sie einen Schnitt durch die Mitte

Die Gewinnung und das Wachstum von Organoiden im Labor ist mühsam, technisch anspruchsvoll und kostspielig. Es erfordert die Kompetenz erfahrener Wissenschaftler und teurer Geräte, abgesehen von den ethischen Überlegungen und der Erlaubnis, mit menschlichem Gewebe zu arbeiten. (Das Human Tissue Act 2004 regelt Aktivitäten bezüglich der Entfernung, Lagerung, Verwendung und Entsorgung von menschlichem Gewebe.) Die Bemühungen sind es jedoch wert, da die resultierenden Strukturen zunehmend dazu genutzt werden, Wissenschaftlern dabei zu helfen, zu verstehen, wie der Körper arbeitet und wie sie potenzielle neue Wirkstoffe testen können.

Was sind von Patienten stammende Organoide?

PDOs sind 3D-Zellstrukturen, die aus „erwachsenen Stammzellen“ im Patientengewebe entstehen und sich regenerieren können, um geschädigtes Gewebe zu erhalten und zu reparieren. Sie verfügen über „vorprogrammierte Anweisungen“, um die spezialisierten Zelltypen zu teilen und zu bilden, die in ihrem spezifischen Ursprungsorgan zu finden sind. Sobald die Zellen gebildet wurden, bauen sie sich selbst zusammen, um dieselbe „Architektur“ zu replizieren, die im Körper zu finden ist. Die sich bildenden Strukturen werden daher als Organoide bezeichnet, da sie „wie ein Organ“ sind. PDOs können aus vielen Organen wie Darm, Herz, Leber, Niere, Pankreas, Lunge, Gehirn und vielem mehr gewonnen werden. Die kleine Größe und die originalgetreue Reproduktion von Patientengewebe außerhalb des Patienten ermöglicht es Wissenschaftlern, PDOs für mehrere Experimente im Labor zu verwenden, die nicht ethisch an den Patienten selbst durchgeführt werden konnten! Zum Beispiel, um das Ansprechen von Patienten auf neuartige Wirkstoffe zu testen und genau vorherzusagen.

Wie ein Bonsaibaum oder eine Baby-Wassermelone sind PDOs nur kleinere Versionen des Originals. Ein Mikroskop ist erforderlich, um sie in jedem Detail betrachten zu können. Der Durchmesser eines Abschnitts des Dünndarms des Darms beträgt etwa 3 Zentimeter (0,03 Meter) und ein Mini-Darm-Organoid, das einige Tage im Labor gezüchtet wurde, ist etwa 75 Mikrometer (0,000075 Meter) groß, d. h. 400 mal kleiner.

Woher kommen PDOs?

Gewebe, aus dem Organoide gewonnen werden, wird mit Einwilligung des Patienten großzügig gespendet. Dies erfolgt in der Regel durch eine Nadelbiopsie, die von einem Arzt durchgeführt wird, um festzustellen, ob das Gewebe gesund ist oder ob der Patient Krebs oder eine andere Krankheit hat. Ein paar Millimeter der Biopsie sind alles, was erforderlich ist. Die Wahrscheinlichkeit, Organoide in Kulturen zu gewinnen, ist mit mehr Gewebe größer, aber es kann immer noch nicht garantiert werden, dass Organoide aus jeder Probe gewonnen werden können.

Schaffung von „Mini-Darm“-Organoiden aus dem Darmgewebe des Patienten: Schritt-für-Schritt-Anleitung

Das Verfahren zur Ableitung von Organoiden aus Patientengewebe variiert je nach Gewebetyp. Verschiedene Labore haben ihre eigenen bevorzugten Methoden, die auf ihre Anforderungen zugeschnitten sind. Je mehr wir über den Prozess erfahren, desto effizienter und erfolgreicher werden die Methoden. Das folgende Beispiel zeigt einen allgemeinen Überblick über die Schritte, die bei der Herstellung von „Mini-Darm“ aus Darmgewebe erforderlich sind. Der Prozess, vom Erhalt der Probe im Forschungslabor bis hin zur Kultur im Inkubator, zur Vorbereitung der Organoidbildung, dauert etwa 4 Stunden. Das Wachstum der Organoide dauert etwa 2 Wochen nach der Gewebevorbereitung.

1. Das Biopsiegewebe des Patienten wird den verschiedenen Tests zugeordnet, die für die Diagnose erforderlich sind. Das winzige Stück zur Herleitung von Organoiden wird in eine spezielle Lagerungslösung gegeben und gekühlt, um die Zellen beim Transport ins Forschungslabor am Leben zu erhalten und normal zu funktionieren. (Die gleiche Lösung wird für ganze Organe verwendet, die für die Transplantation benötigt werden.)
2. Im Labor wird die anonymisierte Probe mit 70% Alkohol besprüht und in ein Biological Safety Cabinet (BSC) gegeben. Der Schaltschrank erzeugt Luftströme, die zwischen dem Bediener und der Probe passieren. Dadurch bleibt beides voneinander isoliert.
3. Die Probe wird mit Flüssigkeit gespült, die Nährstoffe und Salze („Medium“) enthält, und mit einem Skalpell sehr fein in eine Petrischale gehackt.
4. Eine Enzymlösung wird hinzugefügt und die Mischung wird etwa 30 Minuten lang in einem Wasserbad bei Körpertemperatur (37°C) inkubiert. Dadurch wird die Struktur des Gewebes aufgebrochen und die „erwachsenen Stammzellen“ freigesetzt, die die Bildung der Organoide ermöglichen.
5. Die enzymatische Verdauung wird mit Medien gestoppt und die Mischung wird mit hoher Geschwindigkeit in einer Zentrifuge zentrifugiert. Das resultierende Pellet wird in frischen Medien resuspendiert. Dieser Schritt kann mehrmals wiederholt werden, um die Probe zu „waschen“.
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7. Das Pellet, das winzige Zellklumpen/Gewebefragmente enthält, wird auf 4 °C gekühlt und vorsichtig in einer gelatineartigen Proteinmischung wie Matrigel oder einem gleichwertigen Protein resuspendiert. Matrigel ist bei 4 °C flüssig und bildet bei Raumtemperatur ein Gel. Dieses Hydrogel bietet Wachstumsfaktoren und strukturelle Unterstützung für die Entwicklung der Zellen in drei Dimensionen. Die Zellen bilden sich zu einem Ball, der wie ein Fußball mit oder ohne Vorsprünge recht abgerundet werden kann. Einige Organoide können in ihrer Gesamtform recht unregelmäßig sein.
8. Kleine Knötchen des Zellfragments und der Matrigelmischung werden auf sterile Petrischalen gelegt. Diese Klumpen haben ungefähr die Größe eines durchschnittlichen Tropfens Wasser, d. h. 0,05ml. Die Blobs können bei Raumtemperatur gelieren. Ein Flüssigkeitszulauf wird hinzugefügt. Dieser enthält Nährstoffe und zusätzliche Faktoren, die das Wachstum und die Entwicklung der Organoide fördern, ohne die Biologie der Zellen zu verändern. Die Schale wird dann in einen Inkubator gebracht, der eine konstante Temperatur von 37°C und 5 % Kohlendioxid aufrechterhält. (Standardbedingungen für Zellkulturen).
9. Die Flüssigkeitszufuhr wird alle paar Tage erneuert, und Organoide entwickeln sich innerhalb von etwa 2 Wochen. Die Ausbeute ist sehr variabel, von bis hin 0 zu 100 Organoiden pro Biopsie. Dies kann vom Gewebetyp und der Menge der ursprünglichen Biopsieprobe abhängen.

Wie man Organoidzahlen ausbaut

Sobald die PDOs vollständig eingerichtet sind, können sie getrennt werden, um noch viel mehr Kopien auszusäen. Dies kann in nur wenigen Tagen oder alle paar Wochen geschehen und variiert je nach Organtyp und Person, da PDOs, die von jedem Patienten abgeleitet werden, einzigartig sind. Die adulten Stammzellen in den Organoidfragmenten erzeugen neue Zellen und bilden Organoide auf die gleiche Weise, wie sie aus der ursprünglichen Gewebeprobe gebildet wurden, außer dass sie sich schneller bilden, nachdem sie bereits etabliert wurden. Der Prozess, mehr Kopien zu teilen und erneut auszusäen, wird als „Subkultur“ oder „Passage“ bezeichnet und kann mehrfach wiederholt werden, was zu vielen zusätzlichen Kopien führt. Diese können für die Erforschung von Genen und Krankheiten im kleinen Maßstab verwendet werden.

Methode für eine Organoid-Subkultur (Passage)

1. Lösen Sie das Matrigel um die Organoide herum auf
2. Führen Sie die Organoide durch die enge Öffnung einer Pipettenspitze nach oben und unten, um sie mechanisch zu dissoziieren, oder brechen Sie die Zellcluster mithilfe einer chemischen Lösung, die Enzyme enthält, auseinander.
3. Drehen Sie, um die Zellen zu pelletieren, und entfernen Sie die Flüssigkeit.
4. Mischen Sie die Organoidzellen/-fragmente wie zuvor mit frischem Matrigel und Kultur.

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