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GPCRs (G protein-coupled receptors)

GPCRs (G protein-coupled receptors)

GPCRs or G protein-coupled receptors are proteins located on the cell surface that recognize extracellular substances and transmit signals across the cell membrane. GPCRs do this by activating guanine nucleotide-binding proteins (G protein) that are responsible for signal transduction inside the cell. The signal delivery is very important in various cellular responses including cell growth, gene transcription, post-translational changes, and communication with other cells. This brings on adjustments in the body to adapt to the environmental changes such as increased heart rate when feeling threatened or change in vision in response to dim light.

The human genome alone consists of at least 1.000 different GPCRs that detect hormones, lipids, amines, neurotransmitters, and light, among other things.

A GPCR consists of three regions. The extracellular part detects and binds the ligand. Then, the seven-transmembrane region undergoes a conformational change. Finally, this change activates the C-terminus that triggers the corresponding G-protein.


cardiomyocytes screening

iPS cell-derived cardiomyocytes are especially attractive cell models because they represent gene expression profiles as well as phenotypic characteristics similar to native cardiac cells.

GPCRs in drug discovery

 

Changes in GPCR activity lead to abnormalities in cellular signaling pathways, which result in inflammation, cardiovascular diseases, mental disorders, hormonal imbalances, and cancer. That’s why GPCRs are at the center of drug discovery, with approximately 34% of all FDA-approved drugs targeting 108 well-defined GPCRs.

Various assays can be used in drug discovery to monitor GPCR activity and corresponding intracellular changes.

Calcium is an important messenger triggered by GPCR activity. Therefore, changes in intracellular calcium signaling are strong indicators of the activation state of GPCRs. Calcium flux assays can be used to monitor intracellular calcium levels in drug screening.

Monitoring calcium oscillations is also crucial to predicting in vitro toxicity of your drug candidates.

Cyclic Adenosine Monophosphate (cAMP) is another important messenger involved in signal transduction pathways. The change in intracellular cAMP levels indicates the specific GPCR-G Protein coupling. cAMP assays can give valuable information about the GPCR subtypes.

It is also possible to monitor the GPCR activity through transfluor assays, where the main focus is on GPCR desensitization upon ligand binding. These assays can be implemented in drug screening to monitor GPCR activation/deactivation and movement across the cell membrane.

 

Solutions for identifying early leads against GPCRs

 

We offer a variety of assay and instrument solutions to support studies of GPCR and ion channel function including assay kits, cellular screening and imaging systems, and microplate readers.

Here we focus on applications using the FLIPR High-Throughput Cellular Screening System, the Screenworks Peak Pro 2 software module along with various FLIPR assay kits to provide a high-throughput kinetic screening solution for toxicology and lead compound identification.

 

  • Cardiomyocyte

    Cardiomyocyte

    Die frühzeitige Vorhersage der durch Wirkstoffe ausgelösten funktionalen Kardiotoxizität benötigt robuste in-vitro-Systeme, die für das Hoch-Durchsatz-Screening geeignet sind. Readily-available iPSC-derived human cardiomyocytes may be used in conjunction with calcium-sensitive dyes, with beat rates and patterns monitored aschanges in intracellular calcium in response to both GPCRs and ion channels. These calcium peaks can be analyzed with our ScreenWorks Peak Pro 2 software which provides the investigator a suite of powerful tools for quantification of cardiomyocyte activity.

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    Cardiotoxicity: calcium oscillations

    Cardiotoxicity: Calcium oscillations

    Induced pluripotent stem cell (iPSC)- derived cardiomyocytes are a particularly attractive in vitro model system due to their use for evaluation of compound effects on both cardiac function and safety. Calcium signal oscillation reflects changes in cytoplasmic calcium concentration making it possible to use a calcium sensitive dye such as the EarlyTox Cardiotoxicity Kit.

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  • Evaluation of calcium flux

    Calcium-Flux

    Die Ermittlung des Kalzium-Flux ist eine allgemein anerkannte und bewährte Methode zur Messung der zellulären Aktivität. Calcium flux can be used as a measurement for a host of cellular processes including neurotransmitter release, GPCR activity, ligand gated ion channels, and cardiomyocyte beat patterns, among many others. The FLIPR System is the drug discovery tool for evaluation of calcium flux in high and ultra-high throughput screening due to its ease of use, sensitivity and user configurability.

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    Fura-2 QBT calcium

    Fura-2 QBT Calcium

    Fura-2 dye has long been considered an important tool to measure calcium mobilization in cellular imaging, GPCR mediated intracellular calcium flux, and ion channel activation. This ratiometric dye helps correct for assay inconsistencies in dye loading or cell plating through calculating the fluorescence intensity ratio between bound and free indicators. However washing is required, increasing well-to-well variability and adding time and complexity to each assay.

    The Fura-2 QBT™ Calcium Kit from Molecular Devices incorporates proven quench based technology with a ratiometric Fura-2 calcium indicator to provide a homogenous assay to minimize cell based variability, while increasing throughput through elimination of cell washing prior to detection.

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  • Homogene Lösungen für GPCR-Assays

    Homogene Lösungen für GPCR-Assays

    Zellbasierte Assays sind im frühen Stadium des Wirkstoffforschungsprozesses zu einer unverzichtbaren Methode für das Screening und Verbindungs-Profiling geworden. Bis heute haben sich solche Assays als eine der zuverlässigsten und reproduzierbarsten Methoden bewiesen, die für Studien zur Beschreibung von Rezeptoren, in Primärscreening-Kampagnen und in Verbindungs-Screening-Programmen eingesetzt werden. Speziell für die Zielmoleküle von Gq-gekoppelten GPCRs sind homogene fluoreszente Calcium-Flux-Assays mit Maskierungstechnologie die Methode der Wahl.

    Durch die Kombination eines neuartigen Fluorophors und einer erprobten Maskierungstechnologie liefert das FLIPR Calcium 5 Assay Kit eine zuverlässige Pharmakologie, ein größeres Signalfenster und eine verbesserte Leistungsfähigkeit des Assays. With the FLIPR Calcium 5 Assay Kit and the FLIPR System, consistent screening of a variety of receptors and targets, especially those with small calcium signal responses, can be obtained in an easy-to-use, homogeneous format.

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    Live cell Gi - and Gs-coupled GPCR second messenger signaling

    Signalübertragung durch sekundäre Botenstoffe des GPCR

    Detection of Gi and Gs -coupled GPCR second messenger signal activity has been traditionally accomplished using assays such as radioactive binding or endpoint cAMP assays that require cell lysis. Solche Assays messen die Aktivität zu einem einzigen Zeitpunkt in der zellulären Antwort und liefern keine kinetischen Informationen. Eine weitere Option nutzt die erzwungene Kopplung von Gi- und Gs-gekoppelten GPCRs an Gα16, gefolgt von einer Fluoreszenzdetektion des Calcium-Flux nach der Aktivierung des Rezeptors durch einen Agonisten. Auch dieser Assay ist suboptimal, da er Signale nicht über den biorelevanten cAMP-Signalweg übermittelt.

    Here we demonstrate endogenous receptor activity in CHO-K1 and HEK-293 cell lines stably expressing the GloSensor plasmid using the FLIPR System.

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  • Kinetische lebendzell-assays

    Kinetische Lebendzell-Assays

    Die ImageXpress Confocal und Micro 4 High-Content Imaging Systeme bieten optionale Fluidik und Umgebungskontrollmodule an. So wird das Einzelkanalpipettieren zur Zugabe von Verbindungen und der Wechsel von Medien während schneller kinetischer oder ausgedehnter Zeitraffer-Experimente ermöglicht. Der Transfluor Cell-Based GPCR Assay Kit ist ein wertvolles Werkzeug, das während High-Content-Screenings (HCS) verwendet wird, um die Aktivierung G-Protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCR) nachzuverfolgen, indem die Desensibilisierung und das Recycling von GPCRs mittels GFP-markierten ß-Arrestins durch automatisierte Bildanalyse quantifiziert wird.

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    Measure intracellular calcium flux

    Vergleich intrazellulärer Calciummessungen

    G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) spielen in der Signaltransduktion von Zellen eine wichtige Rolle. Wenn der Rezeptor von einem Liganden aktiviert wird, verändert sich die Konformation des Rezeptors und triggert die Aktivierung von G-Proteinen im Inneren der Zelle. Ein aktives G-Protein verfügt über das Potential, viele verschiedene Kaskaden intrazellulärer Botenstoffe zu induzieren, darunter Calcium. The FLIPR System performs high-throughput, functional cell-based assays and is the system of choice in drug discovery for evaluating changes in intracellular calcium detected through use of fluorescent calcium-sensitive reporter dyes. Here we provide a basic protocol for performing a calcium mobilization assay on the FLIPR System using the FLIPR® Calcium Assay Kit, a homogeneous, fast and reliable fluorescence assay.

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  • Überwachung der Aktivität von Gq-Protein-gekoppelten Rezeptoren

    Überwachung der Aktivität von Gq-Protein-gekoppelten Rezeptoren

    Die Aktivierung des Gq-Protein-gekoppelten Rezeptors wird in Lebendzellen üblicherweise in Echtzeit unter Verwendung Kalzium-sensitiver Farbstoffe in einem Fluoreszenzplattenreader überwacht. Gewöhnlich wird das in einen Plattenreader integrierte automatisierte Liquid Handling benötigt, um Verbindungen von Agonisten zu den Zellen auf einer Mikroplatte zu geben, während Messungen in Echtzeit der durch Verbindungen induzierten Veränderungen in den Fluoreszenzintensitätswerte durch das Detektionssystem durchgeführt werden. Die Analyse der sich daraus ergebenden Kinetikmessungen liefert Informationen über die Antwort-Profile der Verbindungen, einschließlich der EC50- und IC50-Werte für Agonisten und Antagonisten.

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    Neuronale assays

    Neuronale Assays

    The FLIPR System is an excellent tool for monitoring calcium flux related to neuronal activity. Neu entwickelte, kommerziell erhältliche iPSC-Neuronen haben das Hoch-Durchsatz-Screening von Neuronen Wirklichkeit werden lassen. Diese Zellen und Assays sind wesentlich für die Überwachung einer Vielfalt von Faktoren, einschließlich der Bedingungen von Nervenzellkulturen, Auswirkungen von Wirkstoff-Verbindungen und der Auswirkungen umweltbedingter Neurotoxine. Die neuronale Aktivität und die Freisetzung von Neurotransmittern kann durch Fluoreszenz-basierte Farbstoffe, die als Kalziumindikatoren dienen, beurteilt werden. So werden schnelle, einfache und leistungsstarke Assays mit skalierbarem Durchsatz kombiniert.

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Resources of GPCRs (G protein-coupled receptors)

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