GPCRs (G-Protein-gekoppelte Rezeptoren)
GPCRs oder G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sind Proteine, die auf der Zelloberfläche lokalisiert sind, extrazelluläre Substanzen erkennen und Signale durch die Zellmembran hindurch übertragen. GPCRs tun dies, indem sie Guanin-Nukleotid-bindende Proteine (G-Proteine) aktivieren, die für die Signalübertragung innerhalb der Zelle verantwortlich sind. Die Signalübertragung ist für verschiedene zelluläre Reaktionen wie das Zellwachstum, die Gentranskription, posttranslationale Veränderungen und die Kommunikation mit anderen Zellen von großer Bedeutung. Dies bewirkt Anpassungen des Körpers an die Umweltveränderungen, wie z. B. eine Erhöhung der Herzfrequenz, wenn eine Bedrohung vermutet wird, oder eine Veränderung der Sehkraft als Reaktion auf gedämpftes Licht.
Allein das menschliche Genom kodiert für mindestens 1.000 verschiedene GPCRs, die u. a. Hormone, Lipide, Amine, Neurotransmitter und Licht erkennen.
Ein GPCR besteht aus drei Bereichen. Der extrazelluläre Teil erkennt und bindet Liganden. Daraufhin durchläuft die sieben Domänen umfassende Transmembranregion eine Konformationsänderung. Zuguterletzt aktiviert diese Veränderung die C-terminale Domäne, die das zugehörige G-Protein aktiviert.
Aus iPS-Zellen erzeugte Kardiomyozyten stellen besonders attraktive Zellmodelle dar, da sie ähnliche Genexpressionsprofile und phänotypische Eigenschaften präsentieren wie native Herzzellen.
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und Ionenkanäle
GPCRs bilden mit 600 bis 1000 Mitgliedern die größte Proteinfamilie. Sie wurden mit vielen normalen biologischen als auch pathologischen Zuständen in Verbindung gebracht. Sie sind auch als Sieben-Transmembran (7-TM)-Rezeptoren bekannt und ca. 45 % der modernen medizinischen Wirkstoffe sind gegen diese Proteinklasse gerichtet. Die Funktionen der GPCRs sind sehr vielfältig und sie erkennen eine Vielzahl von Liganden, einschließlich Photonen, kleiner Moleküle und Proteine.
Ionenkanäle stellen Poren in der Zellmembran dar, durch die Ionen in die Zelle hinein und aus der Zelle heraus gelangen können. Im menschlichen Genom gibt es über 400 Gene für Ionenkanäle. Gegen viele von ihnen wurden Wirkstoffe gerichtet, die jetzt Verkaufsschlager sind. Die direkte Messung der Aktivität von Ionenkanälen wird mit den traditionellen elektrophysiologischen Geräten des Patch-Clamp-Verfahrens durchgeführt. Deren Durchsatz ist jedoch sehr gering. Die Aktivität von Ionenkanälen kann auch indirekt und mit viel höherem Durchsatz durch den Einsatz von Floureszenzfarbstoffen gemessen werden, die gegenüber Veränderungen im Membranpotenzial, Calcium-Flux und Kalium-Flux empfindlich sind.
Überwachung der GPCR-Aktivität für die Wirkstoffforschung
Veränderungen der GPCR-Aktivität führen zu Anomalien in zellulären Signalwegen, die in Entzündungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, psychischen Störungen, hormonellen Ungleichgewichten und Krebs resultieren. Aus diesem Grund stehen GPCRs im Mittelpunkt der Wirkstoffforschung, wobei etwa 34 % aller von der FDA zugelassenen Medikamente gegen 108 gutdefinierte GPCRs gerichtet sind.
Bei der Wirkstoffforschung können verschiedene Assays angewendet werden, um die GPCR-Aktivität und die zugehörigen intrazellulären Veränderungen zu überwachen.
Calcium ist ein wichtiges Botenmolekül, das durch die GPCR-Aktivität aktiviert wird. Daher liefern Veränderungen in der intrazellulären Calcium-Signalgebung starke Hinweise auf den Aktivierungszustand von GPCRs. Calcium-Flux-Assays können eingesetzt werden, um die intrazellulären Calcium-Niveaus während des Wirkstoff-Screenings zu überwachen.
Die Überwachung der Calcium-Oszillationen ist für die Vorhersage der In-vitro-Toxizität von Wirkstoffkandidaten ebenfalls unverzichtbar.
Zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) ist ein weiterer wichtiger Botenstoff, der in Signaltransduktionswegen eine Rolle spielt. Die Veränderung des intrazellulären cAMP-Niveaus zeigt an, dass eine spezifische GPCR-G-Protein-Bindung stattgefunden hat. cAMP-Assays können wertvolle Informationen über die GPCR-Subtypen liefern.
Zudem ist es möglich, die GPCR-Aktivität mithilfe von Transfluor-Assays zu überwachen. Hierbei liegt der Fokus auf der Desensibilisierung der GPCRs nach der Ligandenbindung. Diese Assays können beim Wirkstoffscreening eingesetzt werden, um die GPCR-Aktivierung/-Deaktivierung und die Signalübertragung durch die Zellmembran hindurch zu überwachen.
Lösungen zur Identifizierung früher Anhaltspunkte für die Wirksamkeit gegen GPCRs
Wir bieten eine Vielfalt von Assay- und Instrumentenlösungen zur Unterstützung von Funktionsstudien für GPCRs und Ionenkanäle an, darunter Assay-Kits, zelluläre Screening- und Imaging-Systeme und Mikroplatten-Reader.
Hier konzentrieren wir uns auf Anwendungen, die mit dem FLIPR High-Throughput Cellular Screening System und dem ScreenWorks Peak Pro 2-Software-Modul unter Verwendung verschiedener FLIPR-Assay-Kits durchgeführt werden, um eine Lösung für das kinetische Hochdurchsatz-Screening auf Toxikologie und die Identifizierung von Leitsubstanzen bereitzustellen.