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GPCRs (G-Protein-gekoppelte Rezeptoren)

GPCRs (G-Protein-gekoppelte Rezeptoren)

GPCRs oder G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sind Proteine, die auf der Zelloberfläche lokalisiert sind, extrazelluläre Substanzen erkennen und Signale durch die Zellmembran hindurch übertragen. GPCRs tun dies, indem sie Guanin-Nukleotid-bindende Proteine (G-Proteine) aktivieren, die für die Signalübertragung innerhalb der Zelle verantwortlich sind. Die Signalübertragung ist für verschiedene zelluläre Reaktionen wie das Zellwachstum, die Gentranskription, posttranslationale Veränderungen und die Kommunikation mit anderen Zellen von großer Bedeutung. Dies bewirkt Anpassungen des Körpers an die Umweltveränderungen, wie z. B. eine Erhöhung der Herzfrequenz, wenn eine Bedrohung vermutet wird, oder eine Veränderung der Sehkraft als Reaktion auf gedämpftes Licht.

Allein das menschliche Genom kodiert für mindestens 1.000 verschiedene GPCRs, die u. a. Hormone, Lipide, Amine, Neurotransmitter und Licht erkennen.

Ein GPCR besteht aus drei Bereichen. Der extrazelluläre Teil erkennt und bindet Liganden. Daraufhin durchläuft die sieben Domänen umfassende Transmembranregion eine Konformationsänderung. Zuguterletzt aktiviert diese Veränderung die C-terminale Domäne, die das zugehörige G-Protein aktiviert.


Kardiomyozyten-Screening

Aus iPS-Zellen erzeugte Kardiomyozyten stellen besonders attraktive Zellmodelle dar, da sie ähnliche Genexpressionsprofile und phänotypische Eigenschaften präsentieren wie native Herzzellen.

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und Ionenkanäle

 

GPCRs bilden mit 600 bis 1000 Mitgliedern die größte Proteinfamilie. Sie wurden mit vielen normalen biologischen als auch pathologischen Zuständen in Verbindung gebracht. Sie sind auch als Sieben-Transmembran (7-TM)-Rezeptoren bekannt und ca. 45 % der modernen medizinischen Wirkstoffe sind gegen diese Proteinklasse gerichtet. Die Funktionen der GPCRs sind sehr vielfältig und sie erkennen eine Vielzahl von Liganden, einschließlich Photonen, kleiner Moleküle und Proteine.

Ionenkanäle stellen Poren in der Zellmembran dar, durch die Ionen in die Zelle hinein und aus der Zelle heraus gelangen können. Im menschlichen Genom gibt es über 400 Gene für Ionenkanäle. Gegen viele von ihnen wurden Wirkstoffe gerichtet, die jetzt Verkaufsschlager sind. Die direkte Messung der Aktivität von Ionenkanälen wird mit den traditionellen elektrophysiologischen Geräten des Patch-Clamp-Verfahrens durchgeführt. Deren Durchsatz ist jedoch sehr gering. Die Aktivität von Ionenkanälen kann auch indirekt und mit viel höherem Durchsatz durch den Einsatz von Floureszenzfarbstoffen gemessen werden, die gegenüber Veränderungen im Membranpotenzial, Calcium-Flux und Kalium-Flux empfindlich sind.

 

Überwachung der GPCR-Aktivität für die Wirkstoffforschung

 

Veränderungen der GPCR-Aktivität führen zu Anomalien in zellulären Signalwegen, die in Entzündungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, psychischen Störungen, hormonellen Ungleichgewichten und Krebs resultieren. Aus diesem Grund stehen GPCRs im Mittelpunkt der Wirkstoffforschung, wobei etwa 34 % aller von der FDA zugelassenen Medikamente gegen 108 gutdefinierte GPCRs gerichtet sind.

Bei der Wirkstoffforschung können verschiedene Assays angewendet werden, um die GPCR-Aktivität und die zugehörigen intrazellulären Veränderungen zu überwachen.

Calcium ist ein wichtiges Botenmolekül, das durch die GPCR-Aktivität aktiviert wird. Daher liefern Veränderungen in der intrazellulären Calcium-Signalgebung starke Hinweise auf den Aktivierungszustand von GPCRs. Calcium-Flux-Assays können eingesetzt werden, um die intrazellulären Calcium-Niveaus während des Wirkstoff-Screenings zu überwachen.

Die Überwachung der Calcium-Oszillationen ist für die Vorhersage der In-vitro-Toxizität von Wirkstoffkandidaten ebenfalls unverzichtbar.

Zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) ist ein weiterer wichtiger Botenstoff, der in Signaltransduktionswegen eine Rolle spielt. Die Veränderung des intrazellulären cAMP-Niveaus zeigt an, dass eine spezifische GPCR-G-Protein-Bindung stattgefunden hat. cAMP-Assays können wertvolle Informationen über die GPCR-Subtypen liefern.

Zudem ist es möglich, die GPCR-Aktivität mithilfe von Transfluor-Assays zu überwachen. Hierbei liegt der Fokus auf der Desensibilisierung der GPCRs nach der Ligandenbindung. Diese Assays können beim Wirkstoffscreening eingesetzt werden, um die GPCR-Aktivierung/-Deaktivierung und die Signalübertragung durch die Zellmembran hindurch zu überwachen.

 

Lösungen zur Identifizierung früher Anhaltspunkte für die Wirksamkeit gegen GPCRs

 

Wir bieten eine Vielfalt von Assay- und Instrumentenlösungen zur Unterstützung von Funktionsstudien für GPCRs und Ionenkanäle an, darunter Assay-Kits, zelluläre Screening- und Imaging-Systeme und Mikroplatten-Reader.

Hier konzentrieren wir uns auf Anwendungen, die mit dem FLIPR High-Throughput Cellular Screening System und dem ScreenWorks Peak Pro 2-Software-Modul unter Verwendung verschiedener FLIPR-Assay-Kits durchgeführt werden, um eine Lösung für das kinetische Hochdurchsatz-Screening auf Toxikologie und die Identifizierung von Leitsubstanzen bereitzustellen.

 

  • Kardiomyozyten

    Kardiomyozyten

    Die frühzeitige Vorhersage der durch Wirkstoffe ausgelösten funktionalen Kardiotoxizität benötigt robuste in-vitro-Systeme, die für das Hoch-Durchsatz-Screening geeignet sind. Leicht verfügbare, aus iPSC gewonnene humane Kardiomyozyten können zusammen mit calciumsensitiven Farbstoffen eingesetzt werden. Hierbei werden die Kontraktionsfrequenzen und -muster infolge von Veränderungen des intrazellulären Calciums als Reaktion auf GPCRs und Ionenkanäle überwacht. Diese Calcium-Peaks können mit unserer ScreenWorks PeakPro 2 Software analysiert werden, die dem Forscher eine Auswahl an leistungsstarken Werkzeugen zur Quantifizierung der Kardiomyozytenaktivität zur Verfügung stellt.

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    Kardiotoxizität: Calcium-Oszillationen

    Kardiotoxizität: Calcium-Oszillationen

    Aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) generierte Kardiomyozyten stellen ein besonders attraktives In-vitro-Modellsystem dar, da sie zur Beurteilung von Verbindungswirkungen auf die Herzfunktion als auch auf die Sicherheit verwendet werden können. Die Oszillation des Calciumsignals spiegelt Veränderungen der Calcium-Niveaus im Zytoplasma wider und ermöglicht die Verwendung eines calciumsensitiven Farbstoffs wie dem des EarlyTox Cardiotoxicity Kit.

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  • Beurteilung des Calcium-Flusses

    Calcium-Flux

    Die Ermittlung des Kalzium-Flux ist eine allgemein anerkannte und bewährte Methode zur Messung der zellulären Aktivität. Der Calcium-Fluss kann zur Messung einer ganzen Reihe zellulärer Prozesse genutzt werden, unter anderem der Freisetzung von Neurotransmittern, der Aktivität von GPCRs, der spannungs- oder ligandengesteuerten Ionenkanäle und der Kontraktionsmuster von Kardiomyozyten und vieler anderer mehr. Das FLIPR System ist in der Wirkstoffentdeckung wegen seiner einfachen Handhabung, seiner Empfindlichkeit und der Konfigurierbarkeit durch den Anwender DAS Werkzeug zur Beurteilung des Calcium-Flusses beim Screening im Hoch- und Ultrahochdurchsatz-Format.

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    Fura-2 QBT Calcium

    Fura-2 QBT Calcium

    Der Farbstoff Fura-2 gilt seit langem als ein wichtiges Werkzeug zur Messung der Calciummobilisierung beim zellulären Imaging, des GPCR-vermittelten intrazellulären Calcium-Flusses und der Aktivierung von Ionenkanälen. Diese ratiometrische Färbung hilft bei der Korrektur von durch die Farbstoffbeladung oder die Zellplattierung verursachten Assay-Inkonsistenzen, indem das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten zwischen gebundenen und freien Indikatoren berechnet wird. Allerdings sind Waschschritte erforderlich, wodurch die Variabilität von Well zu Well erhöht wird, und für jeden Assay bedeutet dies zusätzliche Zeit und Komplexität.

    Das Fura-2 QBT™ Calcium Kit von Molecular Devices verbindet die bewährte Quench-basierte Technologie mit einem ratiometrischen Fura-2-Calciumindikator. Dadurch stellt es einen homogenen Assay zur Minimierung der zellbasierten Variabilität bereit und erhöht durch das Wegfallen der Zellwaschschritte vor der Detektion gleichzeitig den Durchsatz.

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  • Homogene Lösungen für GPCR-Assays

    Homogene Lösungen für GPCR-Assays

    Zellbasierte Assays sind im frühen Stadium des Wirkstoffforschungsprozesses zu einer unverzichtbaren Methode für das Screening und Verbindungs-Profiling geworden. Bis heute haben sich solche Assays als eine der zuverlässigsten und reproduzierbarsten Methoden bewiesen, die für Studien zur Beschreibung von Rezeptoren, in Primärscreening-Kampagnen und in Verbindungs-Screening-Programmen eingesetzt werden. Speziell für die Zielmoleküle von Gq-gekoppelten GPCRs sind homogene fluoreszente Calcium-Flux-Assays mit Maskierungstechnologie die Methode der Wahl.

    Durch die Kombination eines neuartigen Fluorophors und einer erprobten Maskierungstechnologie liefert das FLIPR Calcium 5 Assay Kit eine zuverlässige Pharmakologie, ein größeres Signalfenster und eine verbesserte Leistungsfähigkeit des Assays. Mit dem FLIPR Calcium 5 Assay Kit und dem FLIPR Tetra System können in einem einfach anzuwendenden, homogenen Format einheitliche Screenings für eine Vielfalt an Rezeptoren und Zielmolekülen erreicht werden, insbesondere für diejenigen, deren Antworten schwache Calciumsignale erzeugen.

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    Signalgebung durch sekundäre Botenstoffe über an GPCRs gekoppelte Gi- und Gs-Proteine in Lebendzellen

    Signalübertragung durch sekundäre Botenstoffe des GPCR

    Die Detektion der Signalaktivität von Botenstoffen der Gi- und Gs-gekoppelten GPCRs erfolgte traditionell mithilfe von Assays wie radioaktiven Bindungsassays oder Endpunkt-cAMP-Assays, die eine Zelllyse erfordern. Solche Assays messen die Aktivität zu einem einzigen Zeitpunkt in der zellulären Antwort und liefern keine kinetischen Informationen. Eine weitere Option nutzt die erzwungene Kopplung von Gi- und Gs-gekoppelten GPCRs an Gα16, gefolgt von einer Fluoreszenzdetektion des Calcium-Flux nach der Aktivierung des Rezeptors durch einen Agonisten. Auch dieser Assay ist suboptimal, da er Signale nicht über den biorelevanten cAMP-Signalweg übermittelt.

    Hier demonstrieren wir die endogene Rezeptoraktivität in CHO-K1- und HEK-293-Zelllinien, die das GloSensor Plasmid stabil exprimieren, mithilfe des FLIPR System.

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  • Kinetische Assays mit Lebendzellen

    Kinetische Lebendzell-Assays

    Die ImageXpress Confocal und Micro 4 High-Content Imaging Systeme bieten optionale Fluidik und Umgebungskontrollmodule an. So wird das Einzelkanalpipettieren zur Zugabe von Verbindungen und der Wechsel von Medien während schneller kinetischer oder ausgedehnter Zeitraffer-Experimente ermöglicht. Der Transfluor Cell-Based GPCR Assay Kit ist ein wertvolles Werkzeug, das während High-Content-Screenings (HCS) verwendet wird, um die Aktivierung G-Protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCR) nachzuverfolgen, indem die Desensibilisierung und das Recycling von GPCRs mittels GFP-markierten ß-Arrestins durch automatisierte Bildanalyse quantifiziert wird.

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    Messung des intrazellulären Calcium-Flusses

    Vergleich intrazellulärer Calciummessungen

    G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) spielen in der Signaltransduktion von Zellen eine wichtige Rolle. Wenn der Rezeptor von einem Liganden aktiviert wird, verändert sich die Konformation des Rezeptors und triggert die Aktivierung von G-Proteinen im Inneren der Zelle. Ein aktives G-Protein verfügt über das Potential, viele verschiedene Kaskaden intrazellulärer Botenstoffe zu induzieren, darunter Calcium. Mit dem FLIPR System lassen sich funktionelle zellbasierte Hochdurchsatz-Assays durchführen und es ist in der Wirkstoffforschung das System der Wahl zur Beurteilung von Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration, die durch die Verwendung fluoreszenter calciumsensitiver Reporterfarbstoffe nachgewiesen wird. Hier stellen wir ein grundlegendes Protokoll zur Durchführung eines Calciummobilisierungs-Assays auf dem FLIPR System zur Verfügung, für das der FLIPR® Calcium Assay Kit, ein homogener, schneller und zuverlässiger Fluoreszenz-Assay, verwendet wurde.

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  • Überwachung der Aktivität von Gq-Protein-gekoppelten Rezeptoren

    Überwachung der Aktivität von Gq-Protein-gekoppelten Rezeptoren

    Die Aktivierung des Gq-Protein-gekoppelten Rezeptors wird in Lebendzellen üblicherweise in Echtzeit unter Verwendung Kalzium-sensitiver Farbstoffe in einem Fluoreszenzplattenreader überwacht. Gewöhnlich wird das in einen Plattenreader integrierte automatisierte Liquid Handling benötigt, um Verbindungen von Agonisten zu den Zellen auf einer Mikroplatte zu geben, während Messungen in Echtzeit der durch Verbindungen induzierten Veränderungen in den Fluoreszenzintensitätswerte durch das Detektionssystem durchgeführt werden. Die Analyse der sich daraus ergebenden Kinetikmessungen liefert Informationen über die Antwort-Profile der Verbindungen, einschließlich der EC50- und IC50-Werte für Agonisten und Antagonisten.

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    Neuronale Assays

    Neuronale Assays

    Das FLIPR System ist ein ausgezeichnetes Werkzeug zur Überwachung des mit der neuronalen Aktivität im Zusammenhang stehenden Calcium-Flusses. Neu entwickelte, kommerziell erhältliche iPSC-Neuronen haben das Hoch-Durchsatz-Screening von Neuronen Wirklichkeit werden lassen. Diese Zellen und Assays sind wesentlich für die Überwachung einer Vielfalt von Faktoren, einschließlich der Bedingungen von Nervenzellkulturen, Auswirkungen von Wirkstoff-Verbindungen und der Auswirkungen umweltbedingter Neurotoxine. Die neuronale Aktivität und die Freisetzung von Neurotransmittern kann durch Fluoreszenz-basierte Farbstoffe, die als Kalziumindikatoren dienen, beurteilt werden. So werden schnelle, einfache und leistungsstarke Assays mit skalierbarem Durchsatz kombiniert.

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