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TRF, TR-FRET und HTRF

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Überblick TRF / TR-FRET (HTFR)

Zeitaufgelöste Fluoreszenz (TRF)

Messungen der Fluoreszenzintensität (FI) nutzen Standard-Fluorophore wie Fluorescein, deren Emission kurzlebig, im Bereich von Nanosekunden, ist. Die Anregung der Probe und die Messung der Emission finden gleichzeitig statt. Obwohl Mikroplatten-Reader sehr gut darin sind, das für die Anregung eingesetzte Licht aus der Emissionsmessung herauszufiltern, trägt dieses Anregungslicht zusammen mit kurzlebigem Licht, das von Materialien in der Vertiefung oder der Probe emittiert wird, oft zu einem starken Hintergrund bei.

Die zeitaufgelöste Fluoreszenz (time-resolved fluorescence, TRF) verringert den Hintergrund, indem ein Lanthanoid-Fluorophor wie Europium oder Terbium genutzt wird, das eine langlebige Fluoreszenz emittiert. Diese langlebige Fluoreszenz hält über Millisekunden hinweg an. So ermöglicht die Anregung des Fluorophors durch eine Puls-Lichtquelle (z. B. eine Blitzlampe), gefolgt von einer Verzögerung und anschließender Signalmessung („Messfenster“), dass die kurzlebige Fluoreszenz (die nur Nanosekunden andauert) abklingen kann, bevor eine Messung durchgeführt wird. Assays, die die zeitaufgelöste Fluoreszenz anwenden, bieten eine deutliche Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses. Die am häufigsten verwendeten Lanthanoide sind Europium, Terbium und Samarium. Diese werden üblicherweise in Form von Chelat- oder Kryptatkomplexen eingesetzt, die eine gute Signalintensität und -stabilität ermöglichen.

 

 

Zeitaufgelöste Fluoreszenz (TRF)

Zeitaufgelöster Fluoreszenz-Resonanzenergiertransfer (TR-FRET)

 

Zeitaufgelöster Fluoreszenz-Resonanzenergiertransfer (TR-FRET)

Kein FRET

Donor und Akzeptor sind voneinander entfernt

FRET

Donor und Akzeptor sind in unmittelbarer Nähe zueinander

Die TR-FRET kombiniert zeitaufgelöste (time-resolved, TR)-Messungen der Fluoreszenz mit der Technologie des Fluoreszenz-Energieresonanztransfers (FRET). In FRET-Assays werden Biomoleküle (z. B. Proteine) mit Donor- und Akzeptorfluorophoren markiert. Wenn die Biomoleküle interagieren, werden die Donor- und Akzeptorfluorophore in unmittelbare Nähe zueinander gebracht. Wenn der Donor jetzt angeregt wird, kann er seine Emissionsenergie auf den Akzeptor übertragen, der wiederum Fluoreszenz einer spezifischen Wellenlänge emittiert. Die Fluoreszenzemissionen des Donors und des Akzeptors besitzen unterschiedliche Wellenlängen, die ein Mikroplatten-Reader voneinander unterscheiden kann. Dadurch wird eine Quantifizierung der biomolekularen Interaktion möglich.

Indem TR-FRET-Assays Lanthanoid-Fluorophore als Donatoren verwenden, die eine langlebige Fluoreszenzemission aufweisen, nutzen Sie die Vorteile zeitaufgelöster Fluoreszenzmessungen, um die kurzlebige Hintergrundfluoreszenz zu beseitigen. Dank der langlebigen Emission der Donorfluorophore kann in einem TR-FRET die Anregung und Emission sowohl der Donor- als auch der Akzeptorfluorophore auch dann noch gemessen werden, nachdem die kurzlebige Hintergrundfluoreszenz abgeklungen ist.

Homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz (HTRF)

Homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz (HTRF)

Die homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz (homogeneous time-resolved fluorescence, HTRF) ist eine vielseitige Technologie, die von Cisbio zum Nachweis biomolekularer Interaktionen entwickelt wurde. Ein typischer HTRF-Assay verwendet ein Europiumkryptat als einen Donor und das organische Fluorophor d2 als einen Akzeptor. Donor und Akzeptor können eingesetzt werden, um eine Vielfalt von Biomolekülen für Anwendungen zu markieren, die die Epigenetik, Quantifizierung von Biomarkern, GPCR-Signaltransduktion und vieles mehr umfassen. HTRF-Assays benötigen einen Mikroplatten-Reader mit TRF-Detektionsmodus, der durch Cisbio als HTRF-kompatibel zertifiziert ist.

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Vorteile und Überlegungen

Ein Hauptvorteil der TRF- und TR-FRET-Detektion schließt, im Vergleich zur Standard-Fluoreszenz, einen verringerten Hintergrund und ein erhöhtes Signal-Rausch-Verhältnis mit ein, was zu einer höheren Empfindlichkeit führt. Zusätzlich bietet der Assay ein robustes Mix-and-Read-Format, das keinerlei Waschschritte erfordert. Zusammen mit der Stabilität des Assays ermöglicht dies die Automatisierung und Miniaturisierung von Screeninganwendungen.

 

Anwendungen und Assays

TRF und TR-FRET (HTRF) Assays ermöglichen die Analyse molekularer Interaktionen in biochemischen Prozessen und werden weit verbreitet angewendet, um Kinaseassays, zelluläre Signalwege, Protein-Protein-Interaktionen, DNA-Protein-Interaktionen, die Zellzytotoxizität und Rezeptor-Liganden-Bindungen zu untersuchen.

Beispiele für TR-FRET-Assays sind in der Tabelle rechts aufgeführt, zusammen mit einigen weiter unten aufgeführten Ressourcen für die zeitaufgelöste Fluoreszenz.
 

Assay Donor Akzeptor Wellenlängen
HTRF-Eu/rot* Europiumkryptat XL665 oder d2 Ex320 Em1 620/Em2 665
HTRF-Tb/rot* Terbiumkryptat XL665 oder d2 Ex340 Em1 620/Em2 665
HTRF-Tb/grün* Terbiumkryptat Fluorescein oder GFP Ex340 Em1 620/Em2 520
Lanthascreen Tb** Terbiumchelat Fluorescein Ex340 Em1 490/Em2 520
Lanthascreen EU** Europiumchelat Alexa Fluor 647 Ex320 Em1 620/Em2 665
LANCE (original)*** Europiumchelat Surelight® APC Ex320 Em1 620/Em2 665
LANCE Ultra*** Europiumchelat ULight Ex320 Em1 620/Em2 665

  • Zytokin-Assays

    HTRF-Assay für humanes TNFα

    Pro- und anti-inflammatorische Zytokine spielen eine zentrale Rolle bei der Autoimmunität und bei entzündlichen und infektiösen Erkrankungen. Sie sind außerdem Hauptakteure auf den Fachgebieten Stoffwechselerkrankungen und Onkologie, insbesondere der Immunantwort gegen Tumore. HTFR-Assays stellen eine vielseitige Plattform zur Verfügung, um viele verschiedene Zytokine und Chemokine zu quantifizieren, und sie sind dazu geeignet, in zellbasierten Experimenten die Freisetzung von Zytokinen und Chemokinen zu überwachen. Der SpectraMax i3x Multi-Mode Mikroplatten-Reader und das SpectraMax® MiniMax™ 300 Imaging Cytometer versetzen die Benutzer in die Lage, HTFR- und Zellviabilitätsmessungen durchzuführen sowie die Assayqualität zu überwachen, indem das Aussehen der Zellen beobachtet wird.

    Erkunden Sie unsere Ressourcen für Zytokin-Assays:

    E-Book: Mit HTFR vom ELISA zur Epigenetik

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    Überwinden Sie Herausforderungen bei der HTRF-Detektion mit optimierten Mikroplatten-Reader-Einstellungen und vereinfachter Analyse.

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  • HTRF-cAMP-Assays, Gαi/o-gekoppelte Rezeptoren

    HTRF-Assays mit cAMP Dynamic 2 und IP-One Kit

    Zyklisches AMP (cAMP, zyklisches Adenosin-3’, 5’-Monophosphat) ist ein wichtiger Second Messenger der GPCR-Signaltransduktion. Die Bildung von cAMP ist wahrscheinlich der am besten untersuchte Signaltransduktionsweg, und er ist an der Reaktion auf sensorische Reize, Hormone, Nervenübertragung und vielem mehr beteiligt. Infolge der Ligandenbindung an einen GPCR tritt eine Konformationsänderung auf, die den Rezeptor aktiviert und wiederum ein G-Protein aktiviert. Die Aktivierung von Gαi/o-gekoppelten Rezeptoren hemmt die Erzeugung von cAMP durch die Adenylatcyclase.

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    HTRF-cAMP-Assays, Gαs-gekoppelte Rezeptoren

    HTRF-cAMP-Assays

    Zyklisches AMP (cAMP, zyklisches Adenosin-3’, 5’-Monophosphat) ist ein wichtiger Second Messenger der GPCR-Signaltransduktion. Die Bildung von cAMP ist wahrscheinlich der am besten untersuchte Signaltransduktionsweg, und er ist an der Reaktion auf sensorische Reize, Hormone, Nervenübertragung und vielem mehr beteiligt. Infolge der Ligandenbindung an einen GPCR tritt eine Konformationsänderung auf, die den Rezeptor aktiviert und wiederum ein G-Protein aktiviert. Die weitere Signaltransduktion hängt vom Typ des aktivierten G-Proteins ab, jedoch führt die Aktivierung von Gαs zur Hochregulation von cAMP durch die Adenylatcyclase.

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  • HTRF-Assay

    HTRF-Assay

    Die HTRF-Assays von Cisbio haben sich weiterentwickelt und umfassen nun die Anwendungsgebiete G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, Kinasen und Zellsignale, Epigenetik und Biomarker. Es steht eine große Vielfalt an Toolbox-Reagenzien und Kits zur Verfügung, um sich mit Protein-Protein-Interaktionen, nukleären Rezeptorassays, Rezeptordimerisierung, Ligandenbindung, Rezeptorinternalisation, Enzymassays und mehr zu befassen.

    Die HTRF schließt die Verwendung von zwei Fluorophoren mit ein, einem Donor und einem Akzeptor, um Proteine und andere zu untersuchende Biomoleküle zu markieren. Wenn die Biomoleküle interagieren, ermöglicht ihre räumliche Nähe einen Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FRET), der vom Fluorophor des Donors zu dem des Akzeptors stattfindet. Die Verwendung lang anhaltend fluoreszenter Lanthanoid-Kryptate als Donoren ermöglicht HTFR-Assays mit zeitaufgelöster Detektion und minimiert die kurzlebige Hintergrundfluoreszenz von Verbindungen und anderem Material. Die Detektion eines zeitaufgelösten (time-resolved) FRET (TR-FRET) mit einem Mikroplatten-Reader ermöglicht die Messung biomolekularer Bindungen.

    HTRF-kompatible Mikroplatten-Reader

    HTRF-kompatible Mikroplatten-Reader

    Die besten HTRF-Ergebnisse zu erhalten, erfordert einen Mikroplatten-Reader, der dahingehend validiert wurde, dass er die technischen Daten, die von Cisbio für die HTRF-Leistung vorgegeben wurden, erfüllt. Die Optik, Energiequelle und die Detektoren sowie die Einstellungen, die für die HTRF verwendet werden, all das wirkt sich auf die Leistung aus. Unsere Reader verwenden für die HTFR-Detektion optimierte Komponenten, einschließlich einer HTRF-Detektionskartusche für die SpectraMax i3x und Paradigm Multi-Mode Microplate Reader und ein verbessertes TRF-Modul plus validierte Filter für den SpectraMax iD5 Reader.

    Das HTRF-Zertifizierungsprogramm von Cisbio garantiert, dass Reader, die das “HTRF-kompatibel”-Logo tragen, die technischen Daten erfüllen, die für eine optimale HTRF-Leistung erforderlich sind. Dieser technische Hinweis stellt die optimierten Einstellungen vor, die durch Cisbio für die HTRF-kompatiblen Mikroplatten-Reader von Molecular Devices validiert wurden.

  • IP-One-Assays, Gαq/11-gekoppelte Rezeptoren

    IP-One-Assays, Gαq/11-gekoppelte Rezeptoren

    Die Phospholipase C (PLC) ist ein weiteres gemeinsames Zielantigen von aktivierten G-Proteinen und spielt in einer Vielfalt von Prozessen eine entscheidende Rolle. Zum Beispiel nutzten Thrombinrezeptoren auf Blutplättchen diesen Signalweg, um die Blutgerinnung voranzutreiben. Die kompetitiven IP-One Immunassays von Cisbio weisen die Anhäufung von Inositolmonophosphat (IP1), einem stabilen, downstream gelegenen Stoffwechselprodukt von IP3 nach, die durch die Stimulation von PLC durch aktivierte Gαq/11-gekoppelte Rezeptoren induziert wird. Das Kit ermöglicht die direkte Charakterisierung von Rezeptoragonisten und -antagonisten, sowohl in adhärenten als auch suspendierten Zellen.

    Kinase-Assays und epigenetische Assays

    Kinase-Assays und epigenetische Assays

    Proteinkinasen sind Enzyme, die in vielen verschiedenen Signaltransduktionswegen Funktionen in der Kontrolle des Zellwachstums, des Stoffwechsels, der Differenzierung und der Apoptose einnehmen. Kinasen stellen nach den GPCRs die zweitwichtigste Gruppe an Zielmolekülen von Wirkstoffen dar. Der Begriff „Epigenetik“ bezieht sich auf die Erforschung erblicher Veränderungen des Phänotyps, die nicht durch Veränderungen in der Nukleotidsequenz hervorgerufen werden, sondern durch Veränderungen wie zum Beispiel die Methylierungsmuster der DNA oder die Modifikation von Histonen. Diese wurden mit der Entstehung vieler verschiedener Erkrankungen in Verbindung gebracht, insbesondere mit Krebs.

    Erkunden Sie unsere Ressourcen für Kinase- und Epigenetik-Assays:

  • Messen Sie den oxidativen Stoffwechsel und die glykolytische Aktivität

    Messen Sie den oxidativen Stoffwechsel und die glykolytische Aktivität

    Um zu überleben und die essentiellsten Bioprozesse durchzuführen, benötigen Zellen Brennstoff in Form von ATP. Dieser Brennstoff wird durch die Glykolyse und die mitochondriale Atmung erzeugt. Beide produzieren ATP, jedoch kann die Glykolyse in Abwesenheit von Sauerstoff stattfinden, während die Mitochondrien für den letzten Schritt der oxydativen Phosphorylierung (OXPHOS) Sauerstoff benötigen. Zu verstehen, wie diese Signalwege auf Effektor-Verbindungen reagieren, kann hilfreiche Einsichten in die Gesamtfunktion von Zellen und die zugrundeliegenden, das Schicksal der Zellen bestimmenden Mechanismen liefern.

    Lesen Sie unsere Application Note, um etwas über die Echtzeit-Datenerfassung und -Analyse während des Verlaufs des Sauerstoffverbrauchs und der glykolytischen Aktivität zu erfahren:

    Optimierte Einstellungen für Transcreener TR-FRET Assays

    Transcreener TR-FRET Assays

    Transcreener® TR-FRET Assays sind einstufige kompetitive Immunoassays, die Nukleotide mithilfe eines dunkelroten zeitaufgelösten Förster-Resonanzenergietransfers (TR-FRET) vermessen. Erfahren Sie, wie man die Einstellungen für Transcreener TR-FRET Assays auf den SpectraMax iD5 und i3x Multimodus-Mikroplatten-Readern optimiert.

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