Zeitaufgelöste Fluoreszenz

Überblick TRF / TR-FRET 

 

Zeitaufgelöste Fluoreszenz (TRF)

Messungen der Fluoreszenzintensität (FI) nutzen Standard-Fluorophore wie Fluorescein, deren Emission kurzlebig, im Bereich von Nanosekunden, ist. Die Anregung der Probe und die Messung der Emission finden gleichzeitig statt. Obwohl Mikroplatten-Reader sehr gut darin sind, das für die Anregung eingesetzte Licht aus der Emissionsmessung herauszufiltern, trägt dieses Anregungslicht zusammen mit kurzlebigem Licht, das von Materialien in der Vertiefung oder der Probe emittiert wird, oft zu einem starken Hintergrund bei.

Die zeitaufgelöste Fluoreszenz (time-resolved fluorescence, TRF) verringert den Hintergrund, indem ein Lanthanoid-Fluorophor wie Europium oder Terbium genutzt wird, das eine langlebige Fluoreszenz emittiert. Diese langlebige Fluoreszenz hält über Millisekunden hinweg an. So ermöglicht die Anregung des Fluorophors durch eine Puls-Lichtquelle (z. B. eine Blitzlampe), gefolgt von einer Verzögerung und anschließender Signalmessung („Messfenster“), dass die kurzlebige Fluoreszenz (die nur Nanosekunden andauert) abklingen kann, bevor eine Messung durchgeführt wird. Assays, die die zeitaufgelöste Fluoreszenz anwenden, bieten eine deutliche Verminderung des Signal-Rausch-Verhältnisses. Die am häufigsten verwendeten Lanthanoide sind Europium, Terbium und Samarium. Diese werden üblicherweise in Form von Chelat- oder Kryptatkomplexen eingesetzt, die eine gute Signalintensität und -stabilität ermöglichen.

 

 

Zeitaufgelöste Fluoreszenz

Zeitaufgelöster Fluoreszenz-Resonanzenergiertransfer (TR-FRET)

 

HTRF-Camp

Kein FRET

Donor und Akzeptor sind voneinander entfernt

FRET

Donor und Akzeptor sind in unmittelbarer Nähe zueinander

Die TR-FRET kombiniert zeitaufgelöste (time-resolved, TR)-Messungen der Fluoreszenz mit der Technologie des Fluoreszenz-Energieresonanztransfers (FRET). In FRET-Assays werden Biomoleküle (z. B. Proteine) mit Donor- und Akzeptorfluorophoren markiert. Wenn die Biomoleküle interagieren, werden die Donor- und Akzeptorfluorophore in unmittelbare Nähe zueinander gebracht. Wenn der Donor jetzt angeregt wird, kann er seine Emissionsenergie auf den Akzeptor übertragen, der wiederum Fluoreszenz einer spezifischen Wellenlänge emittiert. Die Fluoreszenzemissionen des Donors und des Akzeptors besitzen unterschiedliche Wellenlängen, die ein Mikroplatten-Reader voneinander unterscheiden kann. Dadurch wird eine Quantifizierung der biomolekularen Interaktion möglich.

Indem TR-FRET-Assays Lanthanoid-Fluorophore als Donatoren verwenden, die eine langlebige Fluoreszenzemission aufweisen, nutzen Sie die Vorteile zeitaufgelöster Fluoreszenzmessungen, um die kurzlebige Hintergrundfluoreszenz zu beseitigen. Dank der langlebigen Emission der Donorfluorophore kann in einem TR-FRET die Anregung und Emission sowohl der Donor- als auch der Akzeptorfluorophore auch dann noch gemessen werden, nachdem die kurzlebige Hintergrundfluoreszenz abgeklungen ist.

HTRF (Homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz)

TR-FRET

Die homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz (homogeneous time-resolved fluorescence, HTRF) ist eine vielseitige Technologie, die von Cisbio zum Nachweis biomolekularer Interaktionen entwickelt wurde. Ein typischer HTRF-Assay verwendet ein Europiumkryptat als einen Donor und das organische Fluorophor d2 als einen Akzeptor. Donor und Akzeptor können eingesetzt werden, um eine Vielfalt von Biomolekülen für Anwendungen zu markieren, die die Epigenetik, Quantifizierung von Biomarkern, GPCR-Signaltransduktion und vieles mehr umfassen. HTRF-Assays benötigen einen Mikroplatten-Reader mit TRF-Detektionsmodus, der durch Cisbio als HTRF-kompatibel zertifiziert ist.

Bahnbrechende Kundenerfolge

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Vorteile von und Überlegungen zu TRF / TR-FRET

Ein Hauptvorteil der TRF- und TR-FRET-Detektion schließt, im Vergleich zur Standard-Fluoreszenz, einen verringerten Hintergrund und ein erhöhtes Signal-Rausch-Verhältnis mit ein, was zu einer höheren Empfindlichkeit führt. Zusätzlich bietet der Assay ein robustes Mix-and-Read-Format, das keinerlei Waschschritte erfordert. Zusammen mit der Stabilität des Assays ermöglicht dies die Automatisierung und Miniaturisierung von Screeninganwendungen.

 

TRF / TR-FRET (HTRF) Anwendungen und Assays

TRF und TR-FRET (HTRF) Assays ermöglichen die Analyse molekularer Interaktionen in biochemischen Prozessen und werden weit verbreitet angewendet, um Kinaseassays, zelluläre Signalwege, Protein-Protein-Interaktionen, DNA-Protein-Interaktionen, die Zellzytotoxizität und Rezeptor-Liganden-Bindungen zu untersuchen.

Beispiele für TR-FRET-Assays sind in der Tabelle rechts aufgeführt, zusammen mit einigen weiter unten aufgeführten Ressourcen für die zeitaufgelöste Fluoreszenz.
 

Assay Donor Akzeptor Wellenlängen
HTRF-Eu/rot* Europiumkryptat XL665 oder d2 Ex320 Em1 620/Em2 665
HTRF-Tb/rot* Terbiumkryptat XL665 oder d2 Ex340 Em1 620/Em2 665
HTRF-Tb/grün* Terbiumkryptat Fluorescein oder GFP Ex340 Em1 620/Em2 520
Lanthascreen Tb** Terbiumchelat Fluorescein Ex340 Em1 490/Em2 520
Lanthascreen EU** Europiumchelat Alexa Fluor 647 Ex320 Em1 620/Em2 665
LANCE (original)*** Europiumchelat Surelight® APC Ex320 Em1 620/Em2 665
LANCE Ultra*** Europiumchelat ULight Ex320 Em1 620/Em2 665

  • HTRF-Assay für humanes TNFα

    HTRF-Assay für humanes TNFα

    Das Assay-Kit für humanes TNFα ermöglicht eine direkte quantitative Bestimmung von TNFα. Es nutzt einen Sandwich-Immunassay, der zwei spezifische Antikörper beinhaltet, einen anti-TNFα-Antikörper, der mit Eu-Kryptat markiert ist und einen zweiten anti-TNFα-Antikörper, der mit XL665 oder d2 markiert ist. In Anwesenheit von TNFα binden beide Antikörper an TNFα und bringen beide Marker in unmittelbare Nähe zueinander, so dass ein TR-FRET auftritt (Abbildung 1). Das Signal ist proportional zur Konzentration des Antigens in der Probe.

    In dieser Application Note zeigen wir, wie der SpectraMax Paradigm Multi-Mode-Mikroplatten-Reader genutzt wird, um robuste Zytokin-Assays ohne Waschen mit ausgezeichneten Z‘-Faktoren durchzuführen.

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    Benutzerdefinierte Ruthenium-Nano-TRF-Detektionsplattform

    Ruthenium Nano-TRF Detektionsplattform

    Neuigkeiten: Molecular Devices schließt sich mbit Roche zusammen, um eine benutzerdefinierte Ruthenium-Nano-TRF-Detektionsplattform zu entwickeln

    Die Abteilung für benutzerdefinierte Technologien von Molecular Devices hat sich mit dem Discovery Technologies-Team, pRED von Roche zusammengeschlossen, um ein Hochdurchsatz-Detektionsystem für das Screening während der Wirkstoffentwicklung zu entwickeln, das die firmeneigenen Ruthenium-basierten zeitaufgelösten Nano-TRF® (Nanosecond time-resolved Fluorescence)-Assays von Roche verwendet. Die pRED-Screening-Teams installieren die benutzerdefiniert entwickelte Nano-TRF®-Kartusche in ihre Molecular Devices SpectraMax® Paradigm® Multimodus-Mikroplatten-Reader.

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  • HTRF-Zytokin-Assays zur Überlebensfähigkeit von Zellen normalisieren

    HTRF-Zytokin-Assays zur Überlebensfähigkeit von Zellen normalisieren

    Pro- und anti-inflammatorische Zytokine spielen eine zentrale Rolle in der Autoimmunität und in entzündlichen und infektiösen Erkrankungen. Sie sind außerdem Hauptakteure auf den Fachgebieten Stoffwechselerkrankungen und Onkologie, insbesondere der Immunantwort gegen Tumore. Die homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz (HTRF) von Cisbio Bioassays bietet eine vielseitige Plattform zur Quantifizierung vieler verschiedener Zytokine und Chemokine.

    Diese Application Note demonstriert, wie eine relevante Analyse der Zytokinsezernierung und gleichzeitig der Zellviabilität mit dem SpectraMax i3x® Multi-Mode Mikroplatten-Reader und dem SpectraMax® Minimax® 300 Imaging Cytometer durchgeführt wird.

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    Messen Sie den oxidativen Stoffwechsel und die glykolytische Aktivität

    Messen Sie den oxidativen Stoffwechsel und die glykolytische Aktivität

    Um zu überleben und die essentiellsten Bioprozesse durchzuführen, benötigen Zellen Brennstoff in Form von ATP. Dieser Brennstoff wird durch die Glykolyse und die mitochondriale Atmung erzeugt. Beide produzieren ATP, jedoch kann die Glykolyse in Abwesenheit von Sauerstoff stattfinden, während die Mitochondrien für den letzten Schritt der oxydativen Phosphorylierung (OXPHOS) Sauerstoff benötigen.

    Nutzen dieser Application Note:

    • Messung der extrazellulären Sauerstofferschöpfung und Säurebildung in kultivierten Zellen und Mikroorganismen
    • Empfindliche TRF-Detektion von zwei einfachen Mix-and-Measure-Assays
    • Schnellere Datenerfassung und -analyse mit vorkonfigurierten SoftMax Pro-Protokollen

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  • HTRF-Assays mit cAMP Dynamic 2 und IP-One Kit

    HTRF-Assays mit cAMP Dynamic 2 und IP-One Kit

    Die Leistung des HTRF-Assays auf dem SpectraMax M5e Reader wird hier mit zwei unterschiedlichen HTRF-Assay-Kits, dem cAMP dynamic 2 Kit und dem IP-One Kit demonstriert. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren übermitteln ihre Signale über zwei Hauptsignalwege: die Regulation von cAMP und die Erhöhung intrazellulärer Calciumkonzentrationen, die durch IP3 vermittelt wird. Mit dem cAMP dynamic 2 Kit, werden cAMP-Konzentrationen mithilfe eines mit einem Eu-Kryptat markierten monoklonalen anti-cAMP-Antikörpers und d2-markiertem cAMP bestimmt. Der IP-One-Assay hat ein ähnliches Format und nutzt einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch für IP1 ist. IP1 ist ein stabileres Downstream-Metabolit von IP3, das sich in Gegenwart von Lithiumchlorid in signalisierenden Zellen anhäuft.

    Diese Application Note präsentiert sowohl Daten zellbasierter Assays als auch Standardkurven, die mit den cAMP dynamic 2 und IP-One Kits erzeugt wurden. Diese HTRF-Daten demonstrieren den ausgezeichneten dynamischen Bereich und die Z’-Faktoren, die mit dem SpectraMax M5e Reader erhalten werden können.

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    HTRF-Assay mit cAMP HiRange Kit

    HTRF-Assay mit cAMP HiRange Kit

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    Das HTRF cAMP HiRange Kit ermöglicht die Quantifizierung von zyklischem AMP (cyclic adenosine 3’, 5’-monophosphate, cAMP) in Zellproben. cAMP ist ein wichtiger Botenstoff in der Signaltransduktion G-Protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCRs). Infolge der Ligandenbindung an einen GPCR tritt eine Konformationsänderung auf, die den Rezeptor aktiviert und wiederum ein G-Protein aktiviert.

    In dieser Application Note zeigen wir, wie die SpectraMax® Multi-Mode Mikroplatten-Reader eingesetzt werden, um robuste, Hochdurchsatz HTRF®-Assays mit ausgezeichneten Z’-Faktoren und hoch reproduzierbaren EC50-Werten durchzuführen.

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Ressourcen für die zeitaufgelöste Fluoreszenz (TRF) / TR-FRET (HTRF)

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