Fluoreszenz- Polarisation (FP)
Die Fluoreszenzpolarisation (FP) ist eine Technik, die weitverbreitet angewendet wird, um Bindungsereignisse in Lösungen zu überwachen. Sie kann angewendet werden, um biomolekulare Interaktionen, einschließlich der Protein-Antikörperbindung und der DNA-Hybridisierung, sowie die Enzymaktivität zu beurteilen, und sie wurde sowohl auf die Grundlagenforschung als auch auf das Hochdurchsatz-Screening angepasst.
Ein kleines, fluoreszenzmarkiertes Molekül (Tracer), das mit linear polarisiertem Licht angeregt wurde, emittiert hauptsächlich polarisiertes Licht, da der Tracer in der Zeit zwischen Anregung und Emission schnell rotiert. Wenn der Tracer jedoch ein wesentlich größeres Molekül bindet, rotiert er langsamer und das emittierte Licht bleibt zum größten Teil polarisiert.
Fluoreszenzpolarisation G-Faktor
Die Polarisation, ausgedrückt in Millipolarisationseinheiten, oder mP, wird aus den Messwerten der senkrechten (Iperp) und der parallelen (Ipara) Fluoreszenzintensität berechnet, die relativ zur Richtung des polarisierten Anregungslichtstrahls detektiert werden (siehe Formel unten). Der G-Faktor (G) wird zur Korrektur der durch optische Komponenten wie Filter, Polarisatoren und Monochromatoren ausgelösten Effekte eingesetzt, die sich auf die Polarisationswerte auswirken können.
Je größer das fluoreszenzmarkierte Molekül oder das Molekül, an das der Tracer gebunden ist, desto größer ist der mP-Wert.
Vorteil der FP gegenüber Bindungsassays
Die FP kann angewendet werden, um Rezeptor-Liganden-Interaktionen, Protein-DNA-Interaktionen, die Proteolyse, Membranfluidität, Enzym-Assays und mehr zu untersuchen. FP-Assays wurden erfolgreich angewendet, um eine große Vielfalt an Zielmolekülen zu erforschen, darunter Kinasen, Phosphatasen, Proteasen, G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GCPRs) und nukleäre Rezeptoren.
Durch die folgenden Vorteile sind FP-Assays besonders geeignet für High-Throughput-Screenings:
- Homogen (keine Waschschritte erforderlich)
- Nicht-radioaktiv
- Ratiometrisch (einzelne Wellenlänge)
- Miniaturisierbar
IMAP-Phosphodiesterase-Assays auf SpectraMax Multi-Mode Mikroplatten-Readern
Die IMAP® Technology von Molecular Devices ermöglicht schnelle, homogene und nicht-radioaktive Assays für Kinasen, Phosphatasen und Phosphodiesterasen und ist sowohl für die Assay-Entwicklung als auch das Hochdurchsatz-Screening geeignet. IMAP-Assays basieren auf der Bindung von Phosphat an immobilisierte Metall-Koordinationskomplexe auf Nanopartikeln. Wenn die IMAP-Bindungseinheit an ein phosphoryliertes Substrat bindet, verändert sich die molekulare Bewegung des Peptids und die Fluoreszenzpolarisation (FP) der an das Peptid gehefteten fluoreszierenden Markierung erhöht sich (Abbildung 1, links). In einer TR-FRET-Version des Assays ermöglicht die Einbindung eines Terbium (Tb)-Donors einen Fluoreszenzenergietransfer, der auftritt, wenn phosphoryliertes Substrat vorhanden ist (Abbildung 1, rechts). Die Detektion dieses Assays erfolgt im zeitaufgelösten Modus, der die Fluoreszenzinterferenz von Assaykomponenten oder Verbindungen in einem Screen virtuell beseitigt. Ein TR-FRET bietet auch Flexibilität hinsichtlich der Substratgröße und -konzentration.
Zyklische Nukleotid-Phosphodiesterasen (PDEs) sind eine Gruppe von Enzymen, die die Phosphodiesterbindungen von cAMP und cGMP abbauen, sekundären Botenstoffen, die an einer Vielfalt biologischer Prozesse beteiligt sind. Aufgrund ihrer Bedeutung für medizinische Bereiche, wie Herzerkrankungen, Demenz, Depression und weitere, haben sie sich zu einer wichtigen Klasse an Zielmolekülen entwickelt, gegen die Wirkstoffe gerichtet werden können. Hier demonstrieren wir, wie Verdünnungs- und Inhibitionskurven für das PDE-Enzym mit der IMAP-Technologie und den SpectraMax® Multi-Mode Mikroplatten-Readern und der SoftMax® Pro Software erstellt werden können.
Abbildung 1: Mithilfe eines fluoreszenzmarkierten Substrats wird eine Phosphodiesterase-Reaktion durchgeführt. Dann wird eine Bindungslösung hinzugegeben, die große, auf M(III) basierende Nanopartikel enthält. In der FP-Messung (links) bindet das kleine, phosphorylierte, fluoreszente Substrat an die großen Nanopartikel, wodurch die Rotationsgeschwindigkeit des Substrats reduziert und dessen Fluoreszenzpolarisation gesteigert wird. In der TR-FRET-Messung (rechts) binden sowohl das phosphorylierte Substrat als auch der Tb-Donor an die Nanopartikel und bringen den Tb-Donor nahe an den Fluorescein-Akzeptor auf dem Substrat heran, wodurch ein FRET ermöglicht wird.
Arbeitsablauf zur Messung von IgG in der Zelllinien-Entwicklung optimieren
Die Messung der IgG-Produktion ist ein entscheidender Schritt in vielen Entwicklungs- und Produktionsphasen monoklonaler Antikörper. Häufig angewendete Methoden der IgG-Quantifizierung, wie die HPLC und Oberflächen-Interferometrie, erfordern entweder spezielle Instrumente und erfahrenes Personal oder zeitaufwendige Assays wie den ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay). Obwohl der ELISA eine gut etablierte Methode zur Proteinquantifizierung ist, stellt er einen langwierigen Prozess aus vielen Schritten dar. Hier stellen wir die Anwendung des Valita®TITER-Assays von Valitacell zur Messung von IgG-Titern im Verlauf der Antikörperentwicklung und -herstellung vor.
Der ValitaTITER-Assay basiert auf der Detektion von IgG-Fc-Interaktionen mit Protein G mittels Fluoreszenzpolarisations-(FP-)Technologie. Jede Vertiefung einer 96-Well Mikrotiterplatte wird mit einem fluoreszenzmarkierten IgG-bindenden Peptid, dem Protein G, beschichtet. Werden Proben in die Vertiefungen gegeben, werden die Protein-G-Moleküle resuspendiert und Bindungsereignisse finden statt. Die Rate der Molekülbewegung der Protein-G-Moleküle verlangsamt sich, wenn diese Antikörper binden, was zu einem Anstieg der FP-Werte führt (Abbildung 2).
Abbildung 2: In der Pufferlösung sind ungebundene Protein-G-Moleküle kleiner und rotieren schneller. Als Folge daraus verliert das polarisierte Anregungslicht seine Polarisierung (oben). Wenn die Protein-G-Moleküle an die Antikörper in der Probe binden, verlangsamt sich die Rotation dieser größeren Komplexe und führt zu einer Erhöhung der FP-Werte (unten).
Mehr hilfreiche Ressourcen zu Fluoreszenzpolarisationsassays
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Etablierung und Optimierung eines Fluoreszenzpolarisationsassays
Dieser technische Hinweis wurde erstellt, um dem Benutzer Informationen bereitzustellen, die für die Definition der optimalen experimentellen Bedingungen hilfreich sind, wenn bestehende Assays in ein robustes Fluoreszenzpolarisationsformat umgewandelt werden sollen. Als Beispiel dient ein kompetitiver Bindungsassay der Art, die häufig zur Evaluierung der Rezeptor-Liganden-Bindung genutzt wird. Kenntnisse über die grundlegenden Prinzipien der Fluoreszenzpolarisation werden vorausgesetzt.
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IMAP-FP-Kinase-Assays
Proteinkinasen spielen in der Regulation vieler zellulärer Prozesse eine zentrale Rolle. In den letzten Jahren haben sie sich als eine der wichtigsten Klassen von Wirkstoff-Targets für Krebs und viele andere Erkrankungen hervorgetan. Die IMAP® Technology von Molecular Devices ermöglicht schnelle, nicht-radioaktive Assays für ein großes Spektrum an Kinasen und ist sowohl für die Assay-Entwicklung als auch das Hochdurchsatz-Screening geeignet.
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IMAP-Phosphodiesterase-Assay
Die IMAP® Technology bietet eine homogene, nicht auf Antikörpern basierende Plattform zum Screening von Kinasen, Phosphatasen und Phosphodiesterasen. Durch ihre Stabilität und Robustheit kann sie miniaturisiert werden und liefert qualitativ hochwertige Daten mit ausgezeichneten Z’-Faktor-Werten, wodurch sie für das Screening von Inhibitoren geeignet ist. Im Gegensatz zu anderen Methoden misst IMAP die direkte Bindung und erzeugt so relevantere Ergebnisse. IMAP-TR-FRET-Assays ermöglichen zudem eine direkte Bestimmung der Km.
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IMAP-Technologie
Bis zum heutigen Zeitpunkt wurden Kinaseaktivitäts-Assays mit radioaktiven Isotopen oder hochspezifischen Antikörpern durchgeführt. Um dieses Problem zu lösen, führte Molecular Devices seine firmeneigene IMAP® Technology ein und stellte einen nicht-radioaktiven, homogenen Assay zur Verfügung, der für ein großes Spektrum an Kinasen anwendbar ist, unabhängig von den Peptidsequenzen der Substrate. Der Assay stellt ein einfaches „Mix-and-Read“-Verfahren dar, das die genaue Bestimmung der Enzymaktivität ermöglicht.
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Transcreener ADP2 Assays
Transcreener® ADP2 Assays sind homogene Fluoreszenzmessungs-Assays, die die Detektion und das Screening bereits existierender Wirkstoff-Targets, einschließlich Protein- und Lipidkinasen, sowie neu aufkommender Targets wie Kohlenhydratkinasen, Triphosphatasen, Hitzeschockproteine und andere ATPasen ermöglichen. Der Assay basiert auf der Immundetektion von ADP. Um den Bedarf und die Detektionspräferenzen der Benutzer zu erfüllen, stehen drei Detektionsmodi zur Verfügung: Fluoreszenzpolarisation (FP), zeitaufgelöster Förster-Resonanzenergietransfer (TR-FRET) und Fluoreszenzintensität (FI).
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ValitaTITER-Assay
Der ValitaTITER Assay ist eine homogene, Hochdurchsatz-Methode zur schnellen und präzisen Quantifizierung von IgG im Verlauf des Entwicklungsprozesses von Zelllinien. Dieser 96-Well-Assay wurde auf dem SpectraMax iD5 Reader und anderen Mikroplatten-Readern von Molecular Devices mittels FP-Detektion vollständig validiert, um zuverlässige Ergebnisse sicherzustellen. Die SoftMax Pro Software minimiert die Konfigurationszeit für die Detektionseinstellungen und automatisiert die Standardkurvenanpassung und die Probenquantifizierung.
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Erhalten Sie mehr Informationen über die SpectraMax Fluoreszenzpolarisations-Detektionskartusche, die den SpectraMax i3x und Paradigm Systemen eine hohe Empfindlichkeit verleiht.
Videos und Webinare
Assay-Anwendungen ausbauen – mit Multi-Mode-Readern von ELISA bis AlphaScreen
