Elektrophysiologie
Heimat des berühmten Axon-Leitfadens:
Ein Leitfaden zu Verfahren in der Elektrophysiologie und in Biophysik-Laboren
Was ist Elektrophysiologie?
Elektrophysiologie ist das Forschungsfeld, das Veränderungen im Strom durch, oder der Spannung über die Zellmembran untersucht.
Techniken der Elektrophysiologie werden weitreichend über ein vielfältiges Anwendungsspektrum in der Neurowissenschaft und Physiologie eingesetzt. Angefangen vom Verständnis des Verhaltens einzelner Ionenkanäle in einer Zellmembran, über die gesamte Zelle betreffende Veränderungen des Membranpotentials, bis hin zu umfangreicheren Änderungen des Feldpotentials in Gehirnschnitten in vitro oder in Gehirnabschnitten in vivo.
Patch-Clamp-Verfahren, eine der am häufigsten genutzten Elektrophysiologie-Techniken, stellt das beste Werkzeug dar, um die Aktivität von Ionenkanälen zu erforschen. Da diese in vielen neurologischen und kardiovaskulären Erkrankungen eine Hauptrolle spielen, sind sie Hauptforschungsziele für Forscher, ebenso wie ihre physiologische Funktion.
Die Aufzeichnung des extrazellulären Feldpotenzials kann angewendet werden, um die synaptische Aktivität einer Neuronenpopulation zu erforschen. Und sie kann dabei helfen, zu verstehen, wie Informationen im Gehirn verarbeitet werden.
Elektrophysiologie-Labor
Jeder Aufbau eines Elektrophysiologie-Labors ist unterschiedlich und spiegelt die Anforderungen des Experiments oder die Präferenzen des Experimentierenden wider. Hier beschreiben wir die Komponenten und Überlegungen, die allen Aufbauten gemeinsam sind, die zur Messung der elektrischen Aktivität in Zellen gedacht sind. Ein elektrophysiologischer Aufbau stellt vier wichtige Anforderungen an Labore:
- Umgebung – die Maßnahmen zur Gesunderhaltung der Präparation,
- Optik – eine Maßnahme zur Visualisierung der Präparation,
- Mechanik – eine Maßnahme zur stabilen Positionierung der Mikroelektrode und
- Elektronik – eine Maßnahme zur Verstärkung und Aufnahme des Signals.
Die Illustration unten zeigt den Aufbau eines Standard-Teststands in der Elektrophysiologie – ein Tisch und ein Käfig, um den Versuchsaufbau vor externen Interferenzen zu schützen; ein Mikroskop mit einem Mikromanipulator, um die Mikroelektrode stabil zu positionieren; ein Verstärker, um das aufgenommene Signal abzunehmen und zu verstärken; einen Digitalisierer, um das analoge Signal in ein digitales Signal umzuwandeln, und eine Software zur Datenerfassung und -analyse, um sowohl das experimentelle Protokoll zusammenzustellen als auch aussagekräftige Daten und umsetzbare Ergebnisse aus den gesammelten Daten zu extrahieren.
Elektrophysiologie-Lösung: Axon-Ausrüstung
Das Axon™ Instrumenten-Portfolio liefert eine umfassende Lösung für das Patch-Clamping, die Verstärker, Digitalisierer, Software und Zubehör mit einbezieht. Unsere klassenbesten Instrumente ermöglichen die ganze Bandbreite an elektrophysiologischen Patch-Clamp-Techniken, vom kleinsten Einzelkanal bis hin zu den größten makroskopischen Aufzeichnungen.
Die Axon pCLAMP™ 11 Software Suite ist das am häufigsten verwendete Programm zur Erfassung und Analyse elektrophysiologischer Daten und zur Steuerung und Aufzeichnung von Voltage-Clamp-, Current-Clamp- und Patch-Clamp-Experimenten. Einige unten aufgelistete Schlüsselfunktionen unterstützen die Optimierung des Arbeitsablaufs und ermöglichen Ihnen, anspruchsvollere Experimente mit größerer Effizienz durchzuführen und hochqualitative Daten zu erzeugen.
VERSTÄRKER
Was ist ein Patch-Clamp-Verstärker? Ein Instrument, das den Schaltkreis enthält, der für die Messung von durch Ionenkanäle verlaufenden elektrischen Strömen oder Veränderungen des Zellmembranpotenzials erforderlich ist.
Wozu dient es? Zur Messung von Strom- oder Spannungsänderungen. Der Verstärker enthält den Kreislauf, der für die Messung der Größe und Richtung von durch die Zellmembran verlaufenden Strömen erforderlich ist.
Der Verstärker kann auch das Zellmembranpotenzial als Reaktion auf die Strombewegung messen. Um die Strombewegung zu initiieren, kann die das Experiment durchführende Person einen Spannungsbefehl an die Zelle schicken, die wiederum reagiert, indem sie den zur Beibehaltung des Spannungsbefehls notwendigen Strom abgibt. Umgekehrt kann die das Experiment durchführende Person auch Strom injizieren und die durch diese Veränderung der Stromstärke hervorgerufene Veränderung des Membranpotenzials messen. Die Entscheidung, wo das Signal von Interesse verstärkt und gefiltert wird, hat Auswirkungen auf die Signalwiedergabetreue. Idealerweise wird das Signal im Aufzeichnungsinstrument verstärkt. Alle Verstärkermodelle von Axon™ setzen diese Strategie mit variabler Verstärkungskontrolle in der Ausgabe ein, um eine geräuscharme Verstärkung des Pipettenstroms oder des Membranpotenzials zu erzielen. Dadurch, dass die Verstärkung im Aufzeichnungsinstrument stattfindet, wird der Kreislauf zwischen dem leisen Signal und dem Verstärkungskreislauf minimiert, wodurch fremde Geräuschquellen reduziert werden.
Verfügbare Verstärker: Axopatch™ 200B, MultiClamp™ 700B, Axoclamp™ 900A
DIGITALISIERER
Was ist das? Der Digitalisierer ist ein Datenerfassungsinstrument, das analoge Signale in digitale Signale umwandelt.
Wozu dient es? Digitalisierer erfassen Daten für eine Analyse.
Der vom Verstärker erfasste Strom ist ein analoges Signal. Um jedoch die für hochauflösende Patch-Clamp-Messungen benötigte Datenanalyse durchzuführen, muss das analoge Signal in ein digitales umgewandelt werden. Der Digitalisierer wird zwischen dem Verstärker und dem Computer platziert, wo er diese wichtige Aufgabe ausführt. Die vom Computer empfangene Signalqualität ist außergewöhnlich wichtig und wird von der Abtastfrequenz oder Abtastrate bestimmt. Die neueste Generation der Digitalisierer von Digidata® kann bei 500 kHz abtasten und ist mit der HumSilencer™ Funktion ausgestattet, die 50/60 Hz Zeilenfrequenzrauschen beseitigen kann.
Verfügbare Verstärker: Axon™ Digidata® 1550B Low Noise Datenerfassungssystem plus HumSilencer
SOFTWARE
Was ist das? Die Patch-Clamp Daten- und Analysesoftware ist ihre Schnittstelle mit dem Verstärker, dem Digitalisierer und anderen Patch-Clamp-Elektronikgeräten.
Wozu dient es? Zur Datenerfassung und -analyse sowie zur Steuerung des Digitalisierers und des Verstärkers.
Während der Verstärker und der Digitalisierer gemeinsam den wichtigen Kreislauf zur Implementierung eines Patch-Clamp-Experiments enthalten, steuert die Software diese Instrumente, sodass sie die gewünschten Potenziale liefern und den Strom oder die Spannung messen, die sich daraus ergeben. Zudem analysiert die Software das erfasste Signal mit benutzerdefinierten Einstellungen, die die Filterung, Normalisierung, Geräuschbeseitigung, Kurvenanpassung und Parameterbestimmung umfassen können.
Verfügbare Verstärker: pCLAMP™ 11 Software
ELEKTRODENVERBINDUNGSBOX
Was ist das? Ein Gerät, das die Mikropipetten mit integriertem Schaltkreis enthält, sodass elektrische Signale von den Mikropipetten zum Verstärker übertragen werden können.
Wozu dient es? Das von der Mikropipette erfasste elektrische Signal muss zur Signalverarbeitung an Verstärkersysteme übertragen werden.
Jede Elektrodenverbindungsbox ist speziell an den Verstärker angepasst. Alle Elektrodenverbindungsboxen enthalten einen kritischen elektrischen Kreislauf, der Rauschen reduziert. Die Elektrodenverbindungsbox wird auch mechanisch durch den Mikromanipulator gesteuert.
Verfügbare Elektrodenverbindungsboxen: Axon Elektrodenverbindungsboxen
MIKROSKOP MIT MIKROMANIPULATOREN
Was ist das? Das Mikroskop ist ein optisches Vergrößerungswerkzeug. Der Mikromanipulator ist ein Gerät, das die Mikropipette mit nanometergenauer Präzision mechanisch steuert, wobei in der Regel dreidimensionale Bewegungen möglich sind.
Wozu dient es? Damit wird die Mikropipette genau und stabil im Bereich der Zellmembran positioniert, was für eine erfolgreiche Aufzeichnung entscheidend ist.
Die genaue Platzierung einer Patch-Elektrode auf einer 10–20 μm großen Zelle erfordert ein optisches System mit Kontrastverstärkung, das bis zu 300- oder 400-fach vergrößern kann (z. B. Nomarski/DIC, Phase oder Hoffman) und einen Mikromanipulator, der die Elektrode im dreidimensionalen Raum stabil platziert. Ein invertiertes Mikroskop ist vorzuziehen, weil es den leichteren Zugang zu Elektroden von oben ermöglicht und eine größere, stabilere Plattform zur Anbringung des Mikromanipulators bietet. Ein Mikromanipulator kann die Elektrode sehr kleine Strecken entlang der X-, Y- und Z-Achsen verschieben. Der Mikromanipulator kann diese Position dann unbegrenzt lange halten.
FARADAYSCHER KÄFIG UND LUFT-/ANTI-V
Was ist das? Ein Tisch und ein Käfig um Ihre Patch-Clamp-Konfiguration zur Isolierung von Interferenzquellen.
Wozu dient es? Zur Abschirmung Ihrer Konfiguration vor externen Interferenzen.
In Patch-Clamp-Experimenten gemessene elektrische Ströme können sehr klein sein (im Pico-Ampere-Bereich) und alle kleinen Interferenzquellen, wie etwa Radiowellen, können diese Signale verzerren oder verdecken. Ein Faradayscher Käfig ist ein Drahtgeflecht, das Ihr Mikroskop und Ihre Aufzeichnungskammer umgibt. Es verhindert, dass die Elektroden externe Geräuschquellen aufnehmen. Zudem können kleine Vibrationen im Pico-Meter-Bereich Ihre Aufzeichnung stören. Deshalb müssen während Ihres Experiments alle Komponenten perfekt positioniert sein. Zudem werden die Luft- oder Anti-Vibrations-Tische verwendet, um Ihre Konfiguration gegen externe Vibrationsquellen zu isolieren, die diese Ausrichtung stören können.
