Das Oxford Drug Discovery Institute nutzt das FLIPR System, um therapeutische Mechanismen für neurodegenerative Erkrankungen zu erforschen
UNTERNEHMEN/UNIVERSITÄT
Alzheimer’s Research UK finanzierte das Oxford Drug Discovery Institute an der University of Oxford
TEAM-MITGLIEDER
Dr. Franziska Guenther,
Dr. Katherine England,
Dr. James Taylor,
Dr. Emma Mead,
Prof. Paul Brennan,
Prof. John Davis,
Dr. Emma J. Murphy
VERWENDETE PRODUKTE
FLIPR Tetra Zelluläres High-Throughput-Screening-System
ScreenWorks Software
Die Herausforderung
Das Forschungsteam von Dr. Emma J. Murphy widmet sich der Erforschung therapeutischer Ansätze für neurodegenerative Erkrankungen. Zu diesem Zweck untersuchen sie die Auswirkungen von Inhibitoren der Ubiquitin-spezifischen Protease 30 (USP30), die sich als potenzieller therapeutischer Ansatz zur Förderung der Mitophagie (der Beseitigung geschädigter Mitochondrien) bei neurodegenerativen Erkrankungen erwiesen haben.
Um diese Berechnungen mittels kinetischer Charakterisierung mit hohem Durchsatz durchzuführen, hat das Team einen biochemischen Test mit dem FLIPR® Tetra-Instrument entwickelt. Vor der Verwendung des FLIPR® Tetra verwendete das Team einen Mikroplatten-Reader eines Drittanbieters, um die Spaltung eines Substrats mit der Bezeichnung Ub-Rho durch USP30 zu überwachen. Diese Methode, die auf der Messung des Anstiegs der Fluoreszenz basiert, eignete sich hervorragend für die Bestimmung von IC50-Werten (die Konzentration eines Inhibitors, die die Enzymaktivität um 50%) reduziert) im Hochdurchsatzverfahren. Allerdings war der Zugang zu frühen Zeitpunkten und die Durchführung kinetischer Messungen nur begrenzt möglich. Dies lag daran, dass das Substrat in die Platte gegeben werden musste, bevor sie in das Instrument eingesetzt wurde, und die Wells der Platte einzeln gemessen wurden.
Die Lösung
Ursprünglich für die Überwachung des Calcium-Flux in Zellen erworben, hat sich das FLIPR Tetra als außergewöhnliches Werkzeug für die Untersuchung der Enzymkinetik erwiesen. Zusätzlich zu den Calcium-Flux-Assays führt das Team nun verschiedene biochemische Assays mit dem FLIPR Tetra durch, wie z. B. den Phosphat-Produktions-Assay und den bereits erwähnten fluorogenen Deubiquitinase-Assay.
Das FLIPR Tetra hat dem Team als unschätzbare Plattform gedient, die es ihm ermöglicht, biochemische kinetische Assays mit hohem Durchsatz durchzuführen. Dank dieses Ansatzes konnten sie aussagekräftige und zuverlässige Daten generieren und gleichzeitig komplizierte kinetische Parameter schnell bestimmen. Der durch diese Methode erzielte höhere Durchsatz ermöglicht es dem Team, kinetische Daten viel früher im Ablauf der Wirkstoffforschung in wichtige Entscheidungsprozesse einzubeziehen.
Verwendete Produkte
FLIPR Penta Hochdurchsatz-Zell-Screening-System und die ScreenWorks Software
Die Ergebnisse
A) Das Team hat Screenshots aufgenommen, die zeigen, wie die Fluoreszenz im Laufe der Zeit zunimmt, wenn das fluoreszierende Ub-Rho-Substrat vom Enzym in Gegenwart verschiedener Inhibitor-Konzentrationen gespalten wird (links). Zusätzlich haben sie auch einen Screenshot der gesamten Platte aufgenommen, der die Auswirkungen der 16 verschiedenen Inhibitoren in doppelter Ausführung zeigt (rechts).
Um das therapeutische Potenzial der USP30-Inhibition als Mechanismus zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen vollständig zu verstehen, müssen weitere Wirksamkeitsstudien mit diesen Inhibitoren in relevanten Zell- und Tiermodellen durchgeführt werden. Diese Untersuchungen werden Aufschluss über das gewünschte kinetische Profil der USP30-Inhibition und ihre Wirksamkeit bei der Bekämpfung neurodegenerativer Erkrankungen geben.