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Was ist Western Blotting?

Western Blotting ist eine beliebte Technik, die zum Proteinnachweis und zur Proteinquantifizierung angewendet wird. Es ermöglicht die Abtrennung und Identifizierung eines bestimmten Proteins von Interesse aus einem komplexen Proteingemisch, zum Beispiel einem Zelllysat. Durch seine Anwendung in der Diagnostik, Biotechnologie, Molekularbiologie, Proteomik und vielem mehr wird weitverbreitet auf Western Blots vertraut, um die Stärke der Proteinexpression in Zellen zu bestimmen sowie Veränderungen in der Proteingröße und anderen Eigenschaften festzustellen.

 

Western Blot-Methoden

Es können mehrere Western Blot-Methoden in Betracht gezogen werden. Je nachdem welcher sekundäre Antikörper verwendet wird, kann der Nachweis des Zielproteins kolorimetrisch, chemilumineszent oder fluoreszent erfolgen. Diese Methoden werden unten beschrieben und erfordern unterschiedliche Laborausstattungen für den Nachweis. Chemilumineszenz kann zum Beispiel mithilfe eines Röntgenfilms oder mit Instrumenten für digitales Imaging nachgewiesen werden, während ein fluoreszenter sekundärer Antikörper einen Fluoreszenz-Imager benötigt. Jede Nachweisart hat Vorteile und Nachteile, die bei der Auswahl einer Methode berücksichtigt werden müssen.

Eine andere von uns vorgestellte Methode ist das ScanLater™ Western Blot Detection System. Als das erste seiner Art ermöglicht es die Western Blot-Detektion auf einer Multimodus-Mikroplatten-Reader-Plattform. Dieser substratfreie Assay bietet Forschern eine vergleichbare Empfindlichkeit wie herkömmliche Chemilumineszenz- und Fluoreszenz-Assays während er den Western Blot, den ELISA und andere Anwendungen in einem einzigen Reader vereinigt. Unsere unten präsentierten Application Notes liefern weitere Details.

ScanLater Western Blot Detektionskartusche

Das ScanLater™ Western Blot Detection System ermöglicht die Western Blot-Detektion auf einem Mikroplatten-Reader

 

Arbeitsablauf eines Western Blotting-Assays

Dies hier sind die Schritte, die bei einem typischen Western Blot-Assay durchgeführt werden:

Arbeitsablauf eines Western Blot-Assays

 

1. Durchführung der Elektrophorese – Die Proteine werden zuerst mittels Gelelektrophorese nach Größe aufgetrennt.


2. Transfer – Dann werden sie auf eine Blotting-Membran übertragen, die üblicherweise aus Nitrozellulose oder PVDF besteht und mit einem für das Protein von Interesse spezifischen Antikörper inkubiert wird.


3. Blockieren mit Blockierungspuffer – Dies verhindert die Bindung des primären Antikörpers (nächster Schritt) an die Membran selbst.


4. Inkubieren mit primärem Antikörper – Der primäre Antikörper bindet an das Zielprotein.

5. Waschen mit Waschpuffer Ungebundener primärer Antikörper wird weggewaschen.


6. Inkubieren mit sekundärem AntikörperEin sekundärer Antikörper, der den primären Antikörper erkennt und bindet wird hinzugefügt. Dieser sekundäre Antikörper ist mit einem Enzym oder einem anderen Stoff konjugiert, das den Nachweis des Proteins von Interesse ermöglicht, das als Band auf dem Blot sichtbar wird.


7. Waschen mit Waschpuffer Ungebundener sekundärer Antikörper wird weggewaschen.


8. Nachweis durch die Methode / Chemie der Wahl – Das Zielprotein kann in Abhängigkeit vom eingesetzten sekundären Antikörper durch kolorimetrische, fluoreszente oder lumineszente Methoden nachgewiesen werden.

 

 

  • Kolorimetrischer Western Blot

    Kolorimetrischer Western Blot

    Eine kolorimetrische Western Blot-Methode nutzt für den Nachweis einen Enzym-konjugierten sekundären Antikörper und ein chromogenes Substrat.

    Vorteile:

    • Erfordert keine spezielle Ausstattung

    Nachteile:

    • Empfindlichkeit ist eingeschränkt (pg-Bereich)
    • Blots können nicht gestrippt und erneut hybridisiert werden, um weitere Zielproteine zu untersuchen

    Chemilumineszenter Western Blot

    Chemilumineszenter Western Blot

    Ein chemilumineszenter Western Blot verwendet einen Enzym-konjugierten sekundären Antikörper und ein lumineszentes Substrat. Die Ergebnisse werden mithilfe eines Röntgenfilms und einer Dunkelkammer-Ausstattung oder einem digitalen Imaging-System nachgewiesen.

    Vorteile:

    • Empfindlichkeit (fg-Konzentrationen)
    • Blots können gestrippt und erneut hybridisiert werden

    Nachteile:

    • Ergebnisse können nicht-linear sein
    • Signal hat eine kurze Lebensdauer
    • Die für den Nachweis erforderliche Ausstattung kann teuer sein und viel Platz einnehmen

  • Fluoreszenter Western Blot

    Fluoreszenter Western Blot

    Ein fluoreszenter Western Blot verwendet einen sekundären Antikörper, der an ein Fluorophor konjugiert ist, daher wird kein Substrat benötigt. Zum Nachweis der Ergebnisse ist ein Fluoreszenz-Imager erforderlich.

    Vorteile:

    • Größerer dynamischer Bereich und bessere Linearität als kolorimetrische und lumineszente Methoden
    • Multiplexing-fähig durch Nutzung verschiedener Fluorophore

    Nachteile:

    • Kann weniger empfindlich sein als Chemilumineszenz
    • Erfordert ein zugehöriges Fluoreszenz-Imaging-System

    ScanLater Western Blot-Detektionssystem

    ScanLater Western Blot-Detektionssystem

    Beim ScanLater Western Blot Detection System ist der sekundäre Antikörper an ein zeitaufgelöstes Fluorophor konjugiert und kombiniert so die Vorteile von sowohl fluoreszenten als auch chemilumineszenten Methoden.

    • Kein Substrat für den Nachweis erforderlich
    • Signal über Monate oder länger stabil
    • Empfindlichkeit bei sub-Picogramm-Konzentrationen
    • Großer dynamischer Bereich

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  • Nachweis und Quantifizierung von Proteinen mit dem ScanLater Western Blot-Detektionssystem

    Proteinnachweis durch ScanLater Western Blot-Detektion

    Die Detektion von Proteinen ist heute für die pharmazeutische und klinische Forschung äußerst wichtig, und Western Blots gehören mit zu den üblichsten Methoden, die für diesen Zweck angewendet werden. Zum Nachweis des Proteins auf einer Western Blot-Membran werden verschiedene Techniken angewendet, darunter Fluoreszenz und Chemilumineszenz. Jede Technik hat jedoch Ihre Grenzen, und es besteht eine kontinuierliche Notwendigkeit zur Verbesserung der Quantifizierung, Genauigkeit und des dynamischen Bereichs.

    Diese Application Note demonstriert den auf einem reduzierten Hintergrund basierenden erweiterten dynamischen Bereich sowie die Stabilität des Nachweises über die Zeit und einige Messungen hinweg. Zusätzlich zeigt ein Vergleich des ScanLater Western Blot System mit einer Chemilumineszenz-Methode eine verbesserte Empfindlichkeit.

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    Validieren Sie CRISPR-editierte Zellen mittels Imaging und Western Blot-Nachweis

    Validieren Sie CRISPR-Zellen mittels Imaging und Western Blot-Nachweis

    Das Genomeditieren fand weitreichende Anwendung, um die Genexpression und die Funktion von Proteinen zu untersuchen. Aber viele dieser Methoden sind arbeitsintensiv und ungenau.1 Das CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9-System hat sich wegen seiner großen Genauigkeit und der einfachen Anwendung zu einem beliebten Werkzeug für die Genmanipulation entwickelt.2

    Hier zeigen wir, wie der SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader und das ScanLater Western Blot Detection System zur Validierung des Genomeditierens durch CRISPR/Cas9 eingesetzt werden können.

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  • Wells to Westerns: Untersuchung der zellulären Hitzeschockreaktion

    Wells to Westerns: Zelluläre Hitzeschockantwort

    Die Untersuchung einer zellulären Antwort kann mehrere Strategien für den Informationsgewinn umfassen – Imaging, zellbasierte Assays zur Überlebensfähigkeit und Proliferation, Western Blots zur Untersuchung der Proteinexpression und mehr. Oftmals sind mehrere Instrumenten-Plattformen erforderlich, um die benötigten Ergebnisse zu erhalten, und während des Prozesses muss die Nutzung mehrerer Softwarepakete erlernt werden.

    In dieser Application Note zeigen wir, wie Daten für mehrere zusammenhängende Parameter mit einem einzigen Instrument, der SpectraMax® i3 Multi-Mode Detection Platform, erfasst wurden.

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    Abschätzung des Molekulargewichts von Proteinen mit der ScanLater Western Blot Protein Ladder

    Beurteilung des Molekulargewichts von Proteinen

    Die ScanLater™ Western Blot Protein Ladder ist eine wesentliche Komponente des ScanLater™ Western Blot Detection System. Die primären Anwendungen für diese Proteinleiter umfassen die Beurteilung des Molekulargewichts von Proteinen, die visuelle Abbildung einer Gelelektrophorese und die Beurteilung des Transferprozesses von einem Gel auf einen Blot.

    Erfahren Sie, wie Anwender den Arbeitsablauf der Elektrophorese und des Blottings befolgen können, der für ihre Anwendungen optimiert wurde.

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  • Proteinnachweis basierend auf Europium-markierten Proteinen

    Proteinnachweis Europium-markierter Proteine

    Western Blot-Proteindetektion und -quantifizierung auf Grundlage von mit Europium markierten Proteinen mit einem Plattenreader

    Hier berichten wir von einem neuartigen System für die Western Blot-Analyse, das in einen SpectraMax® Multimodus-Mikroplatten-Reader integriert wurde. Die Membranen werden mit Europium-markierten sekundären Antikörpern oder Streptavidin inkubiert, die das zu untersuchende Protein markieren. Europium (Eu) hat eine lange Fluoreszenzlebensdauer im Bereich von 1 ms, und der Nachweis erfolgt mithilfe des Nachweismodus für zeitaufgelöste Fluoreszenz (time resolved fluorescence, TRF). Dieser verringert den durch Autofluoreszenz oder andere Emissionen mit kurzer Lebensdauer verursachten Hintergrund signifikant.

Ressourcen für den Western Blot

Videos und Demonstrationen

ScanLater Western Blot Detektionskartusche

Das ScanLater™ Western Blot Detection System ermöglicht die Western Blot-Detektion auf einem Mikroplatten-Reader

Zugehörige Produkte für den Western Blot