Gen Editing (CRISPR/Cas9) Jüngste Fortschritte zur Verbesserung des klinischen Potenzials
Mehr als 3000 menschliche Gene wurden stark mit Krebs und genetischen Erkrankungen korreliert. Die Aufklärung genetischer Mutationen und menschlicher Erkrankungen wird immer dringlicher. Die vielleicht am besten funktionierende Genom-Editing-Methode wurde durch einen adaptiven Mechanismus der Immunantwort beeinflusst, bei dem Bakterien virale DNA erfassen und spalten, um sie vor viralen Attacken zu schützen. Der Mechanismus wurde später von Doudna und Charpentier et al. angepasst und benannte das Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/CRISPR-assoziierte System (Cas) zur Untersuchung genomischer Veränderungen beim Menschen. Heute ist das CRISPR/Cas-Gen-Editing ein integraler Bestandteil der Gen-basierten Wirkstoffforschung, um Zielgene aufzudecken und Knockouts durchzuführen, die Einblicke in den resultierenden Phänotyp bieten. Aus dieser Perspektive ist diese Technologie ein großer Meilenstein in Richtung der Korrelation von Patientengenom und Phänotyp und der Befähigung der Präzisionsmedizin.
Wie jede andere genomische Modalität muss die CRISPR/Cas-Gentherapie effizient und patientenfreundlich durchgeführt werden. Aktuelle Genabgabemethoden haben jedoch Off-Target-Effekte und einen Mangel an effizientem Knockdown gezeigt.
In diesem Podcast zur Überprüfung der Arzneimittelziele diskutieren Dr. Pietro De Angeli, das Institut für Ophthalmische Forschung am Universitätsklinikum Tübingen, und Dr. Maarten, das Prinzessin Maxima Center, die Sicherheitsprofile der CRISPR/Cas-9Liefermethoden sowie aktuelle Trends in Bezug auf Skalierbarkeit und die Verwendung von Methoden der künstlichen Intelligenz (KI).
Tauchen Sie ein in das Gespräch, in dem wir über die Möglichkeiten diskutieren, die die CRISPR/Cas-Technologie bietet, um die Wirkstoffforschung von Genen zu revolutionieren.
Sicherheitsprofile im Fokus: DNA, mRNA und RNPs in der CRISPR/Cas-Verabreichung
Damit das CRISPR/Cas9-Gen-Editing nahtlos funktioniert, muss der Komplex den Kern erreichen, wo er die Zielgene lokalisieren kann.
Die CRISPR-Abgabe wird durch Plasmid-DNA (pDNA), mRNA oder Ribonukleoproteine (RNP) vermittelt, und die ersten beiden stellen Sicherheitsherausforderungen dar. Die Abgabe durch Plasmid-DNA oder mRNA kann oft zur Aktivierung der angeborenen Immunantwort führen, und pDNA birgt das zusätzliche Risiko der Integration in das Wirtsgenom, was zu langfristigen unerwünschten Wirkungen führt. Obwohl Ex-vivo-Strategien helfen können, diese Risiken vorherzusagen und zu mindern, bleibt die Spezifität von CRISPR/Cas9 ungelöst.
CRISPR/Cas9-Mechanismus. Das Cas9-Enzym wird aktiviert, indem es zunächst an eine Leit-RNA und dann an die passende genomische Sequenz bindet, die unmittelbar vor der aus 3 Nukleotiden bestehenden PAM-Sequenz liegt. Das Cas9-Enzym erzeugt dann einen Doppelstrangbruch, und entweder der NHEJ- oder der HDR-Weg wird genutzt, um die DNA zu reparieren, was zu einer editierten Gensequenz führt.
Um das Risiko des Gen-Editings zu verringern, wenden sich Wissenschaftler RNPs zu, die aus dem Cas9-Protein im Komplex mit einer gezielten gRNA bestehen. Diese Verabreichungsmethode bietet eine verbesserte Spezifität und Sicherheit. Maarten weist bis heute auf die inverse Korrelation zwischen der Zeit, die der Komplex im Wirt verbringt, und der Präzision des CRISPR/Cas9-Gen-Editing hin: „mRNA oder DNA, für die Transkription und Übersetzung von Cas9 ist bis zu eine Woche erforderlich, während ein RNP aktiv ist, sobald es in den Kern eintritt und die Arbeit in weniger als 24 Stunden erledigen kann. Je länger Cas9 im Zellkern verbleibt, desto wahrscheinlicher ist es, dass es außerhalb der Zielregionen auffindet und sich dort ansammelt. Daher ist die sicherste Methode zur Gen-Editierung, einen sehr kurzen Cas9-Puls durch RNP zu erzeugen.“ Ein weiterer Vorteil von RNPs ist die einfache Optimierung, fügt Pietro hinzu. „Bei der Verwendung von RNPs ist es einfacher, die Konzentration Ihrer Reagenzien abzustimmen, was sich auf die Zieleffizienz auswirkt. Während bei der DNA-basierten CRISPR-Verabreichung die Transfektionseffizienz und die Anzahl der DNA-Kopien schwer vorherzusagen und fein abzustimmen sind.“
Eine weitere Herausforderung, die durch DNA- oder mRNA-basiertes CRISPR/Cas9 gestellt wird, besteht darin, dass es das transkriptomische und proteomische Profil des Wirts verändern könnte. Diese Verschiebung tritt hauptsächlich auf, weil der Wirt seine energetischen Ressourcen für die Transkription und Translation von DNA- und mRNA-Formen neu organisiert. Die daraus resultierende Stoffwechselbelastung kann den Wirtsstoffwechsel stören, was das Transkriptom und das Proteasom verändert. Im Gegensatz dazu ist die Verabreichung von CRISPR/Cas9 als RNP ein Komplex, der bereit ist, zu funktionieren und das gewünschte Gen-Editing durchzuführen, sodass er keine Verschiebung des Genoms in Richtung Cas9-Expression verursacht.
Ex-vivo-Anwendungen: Navigation durch die Skalierbarkeit und Machbarkeit von CRISPR
Das CRISPR/Cas9-System kann nicht als nackter Komplex in den Zellkern geleitet werden, daher spielt das geeignete CRISPR-Verband eine wichtige Rolle beim Schutz der Integrität des Komplexes. Um die aktuellen Bemühungen anzugehen, teilen die Wissenschaftler Pionierarbeit aus Forschungslaboren.
Prof. David Liu, Vizevorsitzender der Fakultät am Broad Institute of MIT und Harvard, hat Lipid-Nanopartikel (LNPs) viralen Ursprungs entwickelt, die den Komplex umschließen können. LNPs zeigten eine effiziente Verabreichung in allen Formen von CRISPR/Cas9, einschließlich des vorgeformten RNP. Diese Maschine führte zur Verabreichung des Komplexes an bestimmte Organe von Interesse (Banskota et al., 2022, Cell 185, 250–265). In der Zwischenzeit verbesserte das Labor von Jennifer Doudna die Spezifität von Cas9 an der Stelle, indem es dem C- und dem N-Terminus des Proteins nukleäre Lokalisierungssignale hinzufügte. In-vivo-Experimente bestätigten ein präzises Gen-Editing im Gehirn von Mäusen (Stahl EC, et al., Mol Ther. .–02. Aug.
Während sich die Verabreichungsmethoden weiter verbessern, ist das klinische Potenzial des CRISPR/Cas9-Gen-Editings noch nicht vollständig realisiert, vor allem, weil die Virusabgabe, die mit einem verlängerten Off-Target-Editing assoziiert ist, immer noch der Goldstandard ist. Unter den nicht-viralen Verabreichungsmethoden zeichnet sich die Elektroporation durch ihre sicheren und robusten, mit RNPs kompatiblen Verabreichungsfähigkeiten aus. Diese Methode erzeugt Poren in der Zellmembran, ermöglicht einen nahtlosen RNP-Eintritt in das Zytoplasma und verhindert dessen Endozytose oder endosomalen Austritt.
Weitere Probleme treten bei der Skalierbarkeit auf. Während die Cas9-Endonuklease in großen Chargen ohne große Kosten hergestellt werden kann, ist die Leit-RNA (gRNA) nicht nur spezifisch für die Krankheit oder den therapeutischen Ansatz, sondern auch für Einzelpersonen. Pietro ist der Ansicht, dass der Weg zum gRNA-Scale-Up mit Risiken behaftet ist. „Im Moment sehe ich nicht die Technologie selbst als Problem, sondern den rechtlichen Rahmen. Große Pharmaunternehmen konzentrieren sich auf häufigere Erkrankungen, da sie nach kommerziell tragfähigen Möglichkeiten suchen. Ein Patient, der zu dieser Gruppe gehört, hat eine höhere Chance, auf Gen-Editing-Behandlungen zuzugreifen. Für die Behandlung seltener Krankheiten müssen akademische und gemeinnützige Forschungseinrichtungen Anstrengungen unternehmen, um den Zugang zu Patienten zu erleichtern.“ Laut Maarten muss das regulatorische Verfahren für seltene Krankheiten anders sein: „Für jede Krankheit muss die Sicherheit des Komplexes durch umfangreiche Ex-vivo-Daten nachgewiesen werden. Für seltene Krankheiten mit einer begrenzten Anzahl von Patienten weltweit ist die Erstellung dieses umfassenden Berichts nicht möglich. Derzeit arbeiten Initiativen, die von Jennifer Doudna und anderen CRISPR-Experten gesponsert werden, mit der FDA zusammen, um die präklinischen Datenanforderungen und die IND-Anmeldung für seltene Krankheiten zu verringern.“ Dieser Vorschlag umfasst die Verwendung von Ex-vivo-Geneditierung, um bearbeitete Zellen zu erzeugen, die an Patienten zurückgeführt werden können, sodass das Genomediting als Reagenz und nicht als Medikament betrachtet wird.
Verbesserung der CRISPR-Präzisionsmedizin: Die Synergie von CRISPR/Cas mit KI und ML
Werkzeuge für maschinelles Lernen (ML) und KI – ähnlich wie ihre Auswirkungen in vielen anderen Branchen – werden als bahnbrechende Faktoren im Gen-Editing und in der gengesteuerten Wirkstoffforschung betrachtet. Im Falle von CRISPR/-Cas9 können sie verwendet werden, um große Datensätze mit standortspezifischen und Off-Target-Editings zusammenzustellen und diese mit verschiedenen Basiseditoren oder 3D-RNP-Strukturen zu korrelieren. Algorithmen für maschinelles Lernen können Ihnen die gRNA-Sequenz liefern, die für das Targeting eines bestimmten Gens erforderlich ist, sowie alle Modifikationen auf Proteinebene, die für das Erreichen des Spezifitätsgrads erforderlich sind. So können Wissenschaftler nun die sicherste und effizienteste gRNA entwickeln.
KI-Werkzeuge wurden auch verwendet, um die Wirksamkeit weiterentwickelter Varianten von CRISPR/Cas9 vorherzusagen. Für ein verbessertes Prime-Editing entwickelten Forscher nCas9 – Cas9-Nickase, die mit der Reverse-Transkriptase verschmolzen wurde, um verschiedene Genom-Editing-Typen wie Punktmutationen, Insertionen und Deletionen zu optimieren. Obwohl dieses neuartige System theoretisch eine bessere Prime-Editing-Effizienz bietet, müssen Design und Sicherheit sorgfältig untersucht werden, wo die Vorhersagekraft von KI-Werkzeugen einsetzt. Maarten betont den Wert von KI in der Gen-basierten Wirkstoffforschung: „Es hilft uns, Hunderte von Cas9 - gRNA-Kombinationen zu scannen, um die 10 leistungsstärksten zu erkennen.“
Die Zukunft von CRISPR: Transformieren therapeutischer Ansätze
Konventionelle Genomsequenzierung reicht nicht aus, um den genetischen Kontext von Krankheiten aufzuklären. Während Forscher Zellen von einem Patienten isolieren und das Genom mit gesunden Patienten vergleichen können, deckt dieser Vergleich nicht unbedingt die Tausenden von Punktmutationen ab, die zum Krankheitsphänotyp beitragen. Das CRISPR/Cas9-Genom-Editing hilft, diese Barrieren zu überwinden und profitiert erheblich von der präzisen Krankheitsmodellierung und personalisierten Medizin, um spezifische Mutationen zu bekämpfen. Für Pietro ist die Behandlung nur eine Seite der Münze: „Wir können sie nicht nur als Behandlungstool, sondern auch als Mittel für die Krankheitsforschung verwenden. 3D-Zellmodelle, wie aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) gewonnene Organoide, sind unglaublich wertvoll für die Nachbildung komplexer humaner Biologie. Durch die Einführung einer krankheitsassoziierten Mutation in das iPSC-Genom können wir Zellkulturen erzeugen, die sich in den Krankheitsphänotyp differenzieren können.“ Dieser Aspekt von CRISPR/Cas9 ist eine Aufmerksamkeit wert, da der genetische Hintergrund einer Krankheit für die Entwicklung leistungsstarker therapeutischer Werkzeuge von höchster Bedeutung ist.
Natürlich kann die Rolle der 3D-Zellmodellierung nicht übertrieben werden. Durch 3D-Zellkulturtechnologien und CRISPR/Cas9 können Forscher isogene Zellmodelle erzeugen, die die gesamte genomische Landschaft mit Zellen umfassen, die nur von wenigen Patienten extrahiert wurden.
Fazit – Nächste Schritte in der CRISPR-Forschung und -Anwendung
Die therapeutischen Möglichkeiten, die CRISPR/Cas9 eröffnet, sind groß, insbesondere bei der Bearbeitung von Punktmutationen und der Genreparatur ex vivo und – in Zukunft – in vivo. Dies kann den Zugang zur Behandlung von Patienten mit seltenen Erkrankungen, die zuvor schwer zu zielende Mutationen aufwiesen, verbessern.
Es ist wichtig zu beachten, dass CRISPR keine Einheitslösung ist. Insbesondere wenn es um Krebs geht, macht er den Wert chemotherapeutischer Ansätze nicht ungültig. Im Gegensatz dazu kann es einen synergistischen Effekt erzeugen, indem es in die genomischen Wurzeln der Krankheit eintaucht, während die Wirkstoffverbindung krankheitsassoziierte Mechanismen auf chemoenzymatischer Ebene hemmt. Die Kombination von CRISPR mit FDA-zugelassenen Wirkstoffen kann den Eintritt in die üblichen klinischen Krebsbehandlungsanwendungen beschleunigen.
Im Podcast haben wir innovative CRISPR-Verabreichungsmethoden untersucht, darunter RNPs, technisch veränderte Viruspartikel und Nanopartikelformulierungen, und ihr Potenzial hervorgehoben, CRISPR-Cas9-Anwendungen näher an die klinische Anwendung heranzubringen. Der Schwerpunkt lag auf der Notwendigkeit präziser und effizienter Gen-Editing-Techniken. Um diese wissenschaftlichen Fortschritte zu unterstützen, bieten die ImageXpress High-Content-Imaging-Systeme von Molecular Devices wichtige Einblicke, indem sie eine detaillierte Beobachtung dieser Verabreichungsmechanismen in Zellen ermöglichen. Darüber hinaus verbessert die Integration von Werkzeugen wie den SpectraMax Mikroplatten-Readern und dem FLIPR Penta System unser Verständnis von Zellwachstum, -erhaltung und -funktionalität, insbesondere bei der Arbeit mit komplexen Modellen wie Organoiden. Während die Bedeutung der Optimierung des Forschungsprozesses diskutiert wurde, besprach das Gespräch auch die Rolle der Automatisierung in modernen Laboren. Lösungen wie das CellXpress.ai Automated Cell Culture System unterstützen die Automatisierung des Zellkulturprozesses und tragen zu zuverlässigeren und reproduzierbaren Ergebnissen in der wissenschaftlichen Forschung bei. Automatisierte Lösungen zur Optimierung der IND-Ablage während des klonalen Screenings sind verfügbar, wie der ClonePix 2 Colony Picker mit Monoklonalitätssicherung. Individuell angepasste Laborautomatisierungslösungen wurden als eine Möglichkeit genannt, mit Wissenschaftlern zusammenzuarbeiten, Arbeitsabläufe an die spezifischen Anforderungen ihrer CRISPR-Cas9-Studien anzupassen und so die technologischen Fähigkeiten an das Streben nach bahnbrechenden wissenschaftlichen Entdeckungen anzupassen.