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Monoklonalität

Monoklonalität dokumentieren – eine regulatorische Vorschrift für therapeutische Zelllinien

Was ist Monoklonalität?

Der Begriff „Monoklonalität“ beschreibt eine Zelllinie, die aus einer einzigen Vorläuferzelle (Einzelzelle) hervorgeht – und daher monoklonal ist. Die Entwicklung von Zelllinien und die Sicherstellung der Monoklonalität sind entscheidende Schritte im Herstellungsprozess biopharmazeutischer Moleküle, wie z. B. monoklonaler Antikörper. Eine Zelllinie kann nach der Isolierung einer einzigen überlebensfähigen Zelle, die das Protein von Interesse robust exprimiert, etabliert werden. Einen wesentlichen Meilenstein stellt in diesem Prozess die Dokumentation des Monoklonalitätsnachweises dar, durch den die genetische Reproduzierbarkeit der Zelllinie sichergestellt wird.

Die Dokumentation der Monoklonalität ist eine für therapeutische Zelllinien geltende regulatorische Vorschrift und basiert üblicherweise auf Bildaufnahmen, wobei die Aufnahme einer einzelnen Zelle erfasst und in die Zulassungsunterlagen aufgenommen wird.

Verifizierung der Monoklonalität – Prüfung des Ursprungs einer Kolonie

Verifizierung der Monoklonalität – Prüfung des Ursprungs einer Kolonie Der Verlauf des Wachstums (der Abbildungen) jedes Wells kann bis zum Ausgangspunkt nachverfolgt werden – wodurch ein Nachweis für Monoklonalität erbracht wird

Warum ist Monoklonalität von Bedeutung?

Da die Vorschriften für die Zelllinienentwicklung zunehmend strenger werden, müssen Forscher Einzelzellklonierungen durchführen und Beweise liefern, dass eine Zelllinie von einer einzigen Zelle abstammt – Nachweis der Klonalität. Herkömmliche Klonierungsmethoden (z. B. limitierende Verdünnungsreihen und FACS) nutzen eine statistische Analyse, um das Konfidenzniveau für die Monoklonalität zu bestimmen. Die Dokumentation der Monoklonalität hat jedoch die Notwendigkeit für robustere Technologien und Methodiken bei Bioprozessen gesteigert. Viele Forscher nutzen nun routinemäßig Imaging-Systeme wie den CloneSelect Imager, um die Monoklonalität zu verifizieren und das Zellwachstum in Zellkulturmedien zu überwachen. Zusätzlich.

Monoklonalität hoher Sicherheit für die Zelllinienentwicklung

Die Entwicklung von Zelllinien, die ein bestimmtes Protein von Interesse exprimieren, ist für die Erzeugung von Biologika wesentlich; und die Regulationsbehörden benötigen einen Nachweis der Monoklonalität, um ein Biologikum für den Markt zuzulassen. Die herkömmliche Herangehensweise beinhaltet die Visualisierung der Wells mittels weißem Durchlicht an Tag 0, um das Vorliegen einer einzelnen Zelle zu bestätigen. Diese Herangehensweise ist jedoch nicht ganz problemfrei, da Zelltrümmer und durch die Wells hervorgerufene Artefakte leicht mit Zellen verwechselt werden können. Folglich bewerten die Entwickler von Zelllinien die Zellen üblicherweise im Koloniestadium und verfolgen dann die Ursprünge der Kolonie zurück, um die Monoklonalität zu bestätigen.

Der Arbeitsablauf beleuchtet diesen Prozess der Verifizierung der Monoklonalität, basierend auf einer objektiven Bildanalyse mithilfe des CloneSelect Imager System. Die gleichzeitige Nutzung des CloneSelect Single-Cell Printer zur Sortierung von Einzelzellen verbessert den Arbeitsablauf durch eine Erhöhung der Anzahl wachsender Klone und zusätzlich durch die bildbasierte Sicherstellung der Monoklonalität.

Arbeitsablauf Monoklonalität
Arbeitsablauf Monoklonalität
  1. Sortierung einzelner Zellen in Mikroplatten-Wells – Um sicherzustellen, dass die Zellpopulation genetisch identisch ist, müssen einzelne lebende Zellen isoliert und kloniert werden. Dadurch wird die Heterogenität der Expression wesentlich reduziert.

  2. Screenen der Platte mittels Weißlicht an Tag 0 und an nachfolgenden Tagen – Imaging der Platte an Tag 0 und an den nachfolgenden Tagen. Die Dokumentation der Monoklonalität (eine regulatorische Vorschrift für therapeutische Zelllinien) basiert üblicherweise auf Abbildungen, wobei die Aufnahme einer einzelnen Zelle erfasst und in die Zulassungsunterlagen mit aufgenommen wird.

  3. Überprüfung des Screenings der Platte und Beurteilung des Auswuchses insgesamt (Weißlicht) – Überprüfen und Analysieren der aufgenommenen Bilder zur Nachverfolgung der Zellwachstumsraten, der Konfluenz und der Koloniebildung.

  4. Bestätigung der Monoklonalität und Export der Daten der einzelnen Wells für die Einreichung bei Regulationsbehörden – Bestätigen der Monoklonalität und Exportieren der Daten der einzelnen Wells in Form von detaillierten Berichten für die Einreichung bei den Regulationsbehörden.

Verbessern Sie den klonalen Auswuchs mithilfe eines Single-Cell Sorter

Die Serie der CloneSelect™ Single-Cell Printer umfasst vollautomatisierte Systeme, die eine firmeneigene, auf Mikrofluidik basierende Technologie sowie die Bildanalyse in Echtzeit anwenden, um einzelne Zellen zu sortieren und in Standard-Mikroplatten abzusetzen – während sie gleichzeitig die Monoklonalität durch Bilddokumentation sicherstellen. Sie adressieren die Defizite der limitierenden Verdünnungsreihe und der auf Durchflusszytometrie basierenden Zellsortierung, indem sie bildbasierte Nachweise der Klonalität liefern, schnelles und effizientes Absetzen einzelner Zellen auf Basis von Weißlicht (c. sight- und f. sight-Systeme) oder optional auf Basis von Fluoreszenz (ausschließlich f. sight-Systeme) bieten, nach dem Absetzen ein ausgezeichnetes Zellwachstum und ein minimales Kreuzkontaminationsrisiko sicherstellen und extrem geringe Wartungskosten benötigen. Wenn sie in Kombination mit einem CloneSelect Imager eingesetzt werden, erzielen die Instrumente der Single-Cell-Printer-Serie Verbesserungen in beiden dieser Arbeitsabläufe – sowohl eine Erhöhung der Anzahl wachsender Klone als auch zusätzlich die bildbasierte Sicherstellung der Monoklonalität.

Verbessern Sie den klonalen Auswuchs mithilfe eines Single-Cell Sorter

Die Technologie des CloneSelect™ Single-Cell Printer (A) Nachdem die Kartusche mit einer Zellen enthaltenden Probe beladen wurde, wird die Kartusche im Single-Cell Printer befestigt und der Druckvorgang kann gestartet werden. Während des Druckvorgangs werden durch einen piezogesteuerten Zylinder in einer planbaren Reihenfolge kontinuierlich Tröpfchen erzeugt.
Tröpfchen, die keine Zellen oder mehr als eine Zelle enthalten, werden mithilfe eines Vakuummechanismus direkt unterhalb der Düse abgesaugt.
Wenn Tröpfchen mit einzelnen Zellen identifiziert werden, verhindert ein Schließmechanismus das Vakuum-vermittelte Absaugen und ermöglicht es dem nur eine einzige Zelle enthaltenden Tröpfchen, in das Well zu fallen. (B) Wenn Tröpfchen mit einzelnen Zellen detektiert werden, werden fünf Bilder aufgenommen, um einen Nachweis der Klonalität an der Düse zur Verfügung zu stellen.
Die Bilder 1–3 zeigen die Anwesenheit einer Zelle vor dem Auswurf eines Tröpfchens, Bild 4 markiert die Region, in der sich die einzelne Zelle befindet und Bild 5 zeigt die Düse nach dem Auswurf des Tröpfchens.

Mikroplatten-Imaging, Charakterisierung von Klonen und Erzeugung von Berichten Mikroplatten-Imaging, Charakterisierung von Klonen und Erzeugung von Berichten

(A) Klone, die durch den Druckvorgang eines Single-Cell Printer erzeugt wurden, werden an Tag 10 aufgenommen. Die Funktion „Plate Thumbnail“ ermöglicht die Visualisierung der Kolonien. Mausklicks auf die einzelnen Wells leiten den Benutzer zur Funktion „View Image“, die die Abbildung eines kompletten Wells anzeigt. (B) Die Funktion „Loci Count“ ermöglicht die Optimierung des Auszählens von Kolonien, indem der Bereich und die Kompaktheit (ein Maß für die Rundheit einer Kolonie) angepasst wird. (C) Mit der Funktion „Generate Report“ können für jeden Zeitpunkt in einer Serie Zellregionen (grüne Boxen) festgelegt und angepasst werden, um das Wachstum von einer einzigen Zelle bis zu einem Klon wiederzugeben.

Was ist monoklonal und was nicht

Indem die Software des CloneSelect Imager dazu genutzt wird, die Ansicht einzelner, immobilisierter Kolonien zu vergrößern, ist es möglich, das Wachstum zu verfolgen und zu bestimmen, ob eine Kolonie monoklonal ist, indem die Aufnahmen der Kolonien zu verschiedenen Zeitpunkten überprüft werden. In der Abbildung unten sind die Aufnahmen zweier Kolonien gezeigt. Indem das Wachstum der beiden Kolonien beobachtet und die Aufnahmen bis Tag 0 zurückverfolgt werden, kann bestimmt werden, ob eine Kolonie aus einer oder aus mehreren Zellen hervorgegangen ist. Die Zugabe von Beads (durch die gelben Kreise angezeigt) zum halbfesten Medium dient als eine Referenz für die Position der Kolonie, um zu bestätigen, dass jedes Mal dieselbe Kolonie aufgenommen wurde.

Monoklonale Ein-Zell-Kolonie

Wachstum von CHO-S-Zellen in halbfestem CloneMedia CHO Growth A-Medium Die Aufnahme von Bildern der 6-Well-Platte zu verschiedenen Zeitpunkten erfolgte mit dem CloneSelect Imager. Es kann eindeutig beobachtet werden, dass an Tag 0 in der oberen Reihe eine einzige Zelle vorhanden ist, während in der unteren Reihe zwei Zellen zu sehen sind. Der gelbe Kreis zeigt die Position eines Beads an, das als Positionsreferenz dient, um zu bestätigen, dass über die Wachstumszeit immer dieselbe Kolonie aufgenommen wurde.

Bereitstellung von Bildnachweisen für die Monoklonalität (Bericht)

Den Bildnachweis für die Monoklonalität innerhalb des Entwicklungsprozesses der Zellline zu erbringen ist nicht so einfach, wie das Bild einer einzelnen Zelle zu exportieren. Zum Beispiel sollten auch hochauflösende Aufnahmen des gesamten Wells überprüft werden, um die Abwesenheit einer zweiten Zelle sicherzustellen.

Mit ein paar einfachen Mausklicks führt die Funktion „Monoclonality Report“ des CloneSelect™ Imager die Erzeugung der Bildnachweise durch, die die Bestätigung der Klonalität unterstützen, und organisiert sie in einem einfach weiterzugebenden Bericht – was Forschern die vielen Arbeitsstunden erspart, die sie für eine eigenhändige Durchführung dieses Prozesses investieren müssten.

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Verifizierung der Monoklonalität

Methoden zur Sicherstellung der Monoklonalität

Erfahren Sie mehr über die verschiedenen Methoden zur Verifizierung und Dokumentation der Monoklonalität.

  • Zuverlässige Sicherstellung der Klonalität mit Calcein-AM

    Zuverlässige Sicherstellung der Klonalität mit Calcein-AM

    Zuverlässige Sicherstellung der Klonalität durch Verwendung von Calcein-AM mit minimalen Auswirkungen auf die Überlebensfähigkeit

    Hier präsentieren wir einen optimierten Arbeitsablauf zur Verwendung des fluoreszenten Reagenz Calcein-AM zusammen mit einem Fluoreszenz-fähigen CloneSelect™ Imager. Er weist eine ähnliche Überlebensfähigkeit der Zellen auf wie unter labelfreien Bedingungen, während er gleichzeitig mit hoher Sicherheit einen Klonitätsnachweis liefert.

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    E-Book: Optimieren Sie Ihre hochwertigen Zelllinien

    Optimieren Sie Ihre hochwertigen Zelllinien

    In diesem E-Book präsentieren wir einen Überblick über den Arbeitsablauf bei der Zelllinienentwicklung sowie Hochdurchsatz-Lösungen zur Beschleunigung des Prozesses und zum Ermöglichen einer einfacheren und schnelleren Selektion hochproduktiver Säugetierzelllinien.

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  • Fluoreszenzmethode zur Identifizierung monoklonaler CHO-S-Zellen

    Fluoreszenzmethode zur Identifizierung monoklonaler CHO-S-Zellen

    Schnelle Methoden zur Verifizierung der Monoklonalität für eine beschleunigte Zelllinienentwicklung

    Die Verifizierung der Monoklonalität mittels Weißlicht-Imaging ist möglich, jedoch machen es Zelltrümmer, Staubteilchen und Luftbläschen schwierig und zeitaufwendig, einzelne Zellen zu identifizieren. Dies kann dazu führen, dass sehr wertvolle Klone verworfen werden. Hier präsentieren wir eine Fluoreszenzmethode zur Identifizierung von monoklonalen CHO-S-Zellen mittels CellTracker Green CMDFA.

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    Monoklonalität hoher Sicherheit für die Zelllinienentwicklung

    Monoklonalität hoher Sicherheit für die Zelllinienentwicklung

    Üblicherweise wird eine limitierende Verdünnungsreihe oder ein Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) durchgeführt, um einzelne Zellen in ein Well auszusäen. Anschließend wird mittels Mikroskopie die Anzahl der ausgesäten Zellen in jedem Well bestimmt und deren Wachstum überwacht. Die Verifizierung der Monoklonalität mittels Weißlicht-Imaging ist möglich, jedoch machen es Zelltrümmer, Staubteilchen und Luftbläschen schwierig und zeitaufwendig, einzelne Zellen zu identifizieren. Dies kann dazu führen, dass sehr wertvolle Klone verworfen werden.

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  • Identifizierung monoklonaler, in halbfesten Medien gewachsener CHO-S-Zellen

    Identifizierung monoklonaler, in halbfesten Medien gewachsener CHO-S-Zellen

    Sichere Identifizierung monoklonaler, in halbfesten Medien gewachsener CHO-S-Zellen

    CHO-Zellen in CloneMedia CHO Growth A zu kultivieren ist ein effizienterer Weg für die Klonierung von CHO-Zellen, als limitierende Verdünnungsreihen in Flüssigmedien durchzuführen. Halbfeste Medien immobilisieren Zellen und verhindern das Wandern von Zellen während der routinemäßigen Handhabung. Dies ermöglicht es Forschern, die Vermehrung einer einzigen Zelle zu einer Kolonie sicher nachzuverfolgen.

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    Verbessern Sie die Klonierungseffizienz durch stärkere Sicherstellung der Klonalität

    Verbessern Sie die Klonierungseffizienz durch stärkere Sicherstellung der Klonalität

    Ein Arbeitsablauf, der die Isolierung von Einzelzellen und das Imaging von Mikroplatten kombiniert, verbessert die Effizienz von Klonierungen bei größerer Sicherstellung der Klonalität

    Ein optimierter Arbeitsablauf spart Zeit, Arbeit und verringert die Kosten für Verbrauchsmaterial und Reagenzien, indem er die Effizienz des klonalen Wachstums erhöht und gleichzeitig eine höhere Sicherstellung der Klonalität sowie eine schnelle und zur Einreichung bei Regulationsbehörden fertige Dokumentation bereitstellt.

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  • Monoklonalitätsbericht erstellen

    Die Funktion „Monoclonality Report“ des CloneSelect™ Imager

    Die Funktion „Monoclonality Report“ des CloneSelect™ Imager

    Mit ein paar einfachen Mausklicks führt die Funktion „Monoclonality Report“ des CloneSelect Imager objektiv die Erzeugung der Bildnachweise durch, die die Bestätigung der Klonalität unterstützen, und organisiert sie in einem einfach weiterzugebenden Bericht – was Forschern die vielen Arbeitsstunden erspart, die sie für eine eigenhändige Durchführung dieses Prozesses investieren müssten.

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    Vereinfachen Sie das Screening und die Selektion von Säugetier-Zelllinien

    Vereinfachen Sie das Screening und die Selektion von Säugetier-Zelllinien

    Anwendung des ClonePix Systems zur Feststellung der Monoklonalität

    Das ClonePix System ist ein leistungsstarkes Werkzeug zum schnellen Screening und zur schnellen Isolation sezernierender Säugetier-Zelllinien, die im Allgemeinen für die Produktion therapeutischer Proteine und monoklonaler Forschungs-Antikörper genutzt werden. Die in diesem Tutorial präsentierten Daten untermauern das Konzept, dass das Picken von Säugetierzellkolonien von halbfestem Medium eine effektive Methode ist, um klonale Zelllinien zu isolieren.

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Ressourcen für Monoklonalität

Videos und Webinare

Arbeitsablauf Monoklonalität

Arbeitsablauf Monoklonalität

Zugehörige Produkte und Service