Monoklonalität
Monoklonalität dokumentieren – eine regulatorische Vorschrift für therapeutische Zelllinien
Was ist Monoklonalität?
Der Begriff „Monoklonalität“ beschreibt eine Zelllinie, die aus einer einzigen Vorläuferzelle (Einzelzelle) hervorgeht – und daher monoklonal ist. Die Entwicklung von Zelllinien und die Sicherstellung der Monoklonalität sind entscheidende Schritte im Herstellungsprozess biopharmazeutischer Moleküle, wie z. B. monoklonaler Antikörper. Eine Zelllinie kann nach der Isolierung einer einzigen überlebensfähigen Zelle, die das Protein von Interesse robust exprimiert, etabliert werden. Einen wesentlichen Meilenstein stellt in diesem Prozess die Dokumentation des Monoklonalitätsnachweises dar, durch den die genetische Reproduzierbarkeit der Zelllinie sichergestellt wird.
Die Dokumentation der Monoklonalität ist eine für therapeutische Zelllinien geltende regulatorische Vorschrift und basiert üblicherweise auf Bildaufnahmen, wobei die Aufnahme einer einzelnen Zelle erfasst und in die Zulassungsunterlagen aufgenommen wird.
Warum ist Monoklonalität von Bedeutung?
Da die Vorschriften für die Zelllinienentwicklung zunehmend strenger werden, müssen Forscher Einzelzellklonierungen durchführen und Beweise liefern, dass eine Zelllinie von einer einzigen Zelle abstammt – Nachweis der Klonalität. Herkömmliche Klonierungsmethoden (z. B. limitierende Verdünnungsreihen und FACS) nutzen eine statistische Analyse, um das Konfidenzniveau für die Monoklonalität zu bestimmen. Die Dokumentation der Monoklonalität hat jedoch die Notwendigkeit für robustere Technologien und Methodiken bei Bioprozessen gesteigert. Viele Forscher nutzen nun routinemäßig Imaging-Systeme wie den CloneSelect Imager, um die Monoklonalität zu verifizieren und das Zellwachstum in Zellkulturmedien zu überwachen.
Monoklonalität hoher Sicherheit für die Zelllinienentwicklung
Die Entwicklung von Zelllinien, die ein bestimmtes Protein von Interesse exprimieren, ist für die Erzeugung von Biologika wesentlich; und die Regulationsbehörden benötigen einen Nachweis der Monoklonalität, um ein Biologikum für den Markt zuzulassen. Die herkömmliche Herangehensweise beinhaltet die Visualisierung der Wells mittels weißem Durchlicht an Tag 0, um das Vorliegen einer einzelnen Zelle zu bestätigen. Diese Herangehensweise ist jedoch nicht ganz problemfrei, da Zelltrümmer und durch die Wells hervorgerufene Artefakte leicht mit Zellen verwechselt werden können. Folglich bewerten die Entwickler von Zelllinien die Zellen üblicherweise im Koloniestadium und verfolgen dann die Ursprünge der Kolonie zurück, um die Monoklonalität zu bestätigen.
Der Arbeitsablauf beleuchtet diesen Prozess der Verifizierung der Monoklonalität, basierend auf einer objektiven Bildanalyse mithilfe des CloneSelect Imager System. Die gleichzeitige Nutzung des DispenCell Single-Cell Dispenser zur Sortierung von Einzelzellen verbessert den Arbeitsablauf durch eine Erhöhung der Anzahl wachsender Klone und zusätzlich durch die bildbasierte Sicherstellung der Monoklonalität.
- Sortierung einzelner Zellen in Mikroplatten-Wells – Einzelne, lebensfähige Zellen müssen isoliert und geklont werden, um sicherzustellen, dass die Zellpopulation genetisch identisch ist. Dadurch wird die Heterogenität der Expression wesentlich reduziert.
- WL-Scanplatte an Tag 0 und darauffolgenden Tagen – Bildplatte an Tag 0 und darauffolgenden Tagen. Die Dokumentation der Monoklonalität (eine regulatorische Vorschrift für therapeutische Zelllinien) basiert üblicherweise auf Abbildungen, wobei die Aufnahme einer einzelnen Zelle erfasst und in die Zulassungsunterlagen mit aufgenommen wird.
- Überprüfen des Platten-Scans und Bewerten des Gesamtauswuchses (WL) – Überprüfen und Analysieren der aufgenommenen Bilder zur Nachverfolgung der Zellwachstumsraten, der Konfluenz und der Koloniebildung.
- Bestätigung der Monoklonalität und Export von Well-Daten für den Zulassungsantrag – Bestätigung der Monoklonalität und Export von Well-Daten in einem detaillierten Bericht für den Zulassungsantrag.
Verbessern Sie den klonalen Auswuchs mithilfe einer Single-Cell-Dispension
Die Single-Cell Dispensions-Einheit von DispenCell ist mit einer Sensorspitze ausgestattet, die den Durchgang der Zellen erkennt. Bei jeder foranschreitenden Zelle wird ein einzigartiges elektrisches Signal ausgelöst. Diese einzigartige elektrische Spur wird umgehend aufgezeichnet, so dass der Nutzer unmittelbar nach der Dispension der Zellen den Klonalitätsnachweis überprüfen kann.
Die Technologie ist impedanzbasiert und daher äußerst schonend für die Zellen, wobei ihre Überlebensfähigkeit und Integrität für einen optimalen Auswuchs erhalten bleiben. Der DispenCell verwendet eine sterile Einweg-Messspitze (DispenTip), um den Durchgang jeder Zelle, die durch die DispenTip-Öffnung fließt, zu messen und aufzuzeichnen. Wenn eine Einzelzelle die Öffnung passiert, um in das Well zu fließen, hinterlässt sie eine elektrische Signatur; diese wird als eindeutiger Peak angezeigt, wobei mehrere Peaks aus Dubletten oder mehreren Zellen resultieren.
Eine bildliche Darstellung der vom Dispenser erzeugten Peak-Informationen zweier Wells neben ihren Abbildungen von CSI-FL. Eine mit einem einzelnen Peak und einer Zelle (oben) und eine mit einem Doppelpeak und zwei Zellen (unten). Die Einzelzelle entwickelte sich zu einer Kolonie, und ihr Monoklonalitätsbericht wurde mit der Monoklonalitätsberichts-Funktion des CSI-FL erstellt
Was ist monoklonal und was nicht
Indem die Software des CloneSelect Imager dazu genutzt wird, die Ansicht einzelner, immobilisierter Kolonien zu vergrößern, ist es möglich, das Wachstum zu verfolgen und zu bestimmen, ob eine Kolonie monoklonal ist, indem die Aufnahmen der Kolonien zu verschiedenen Zeitpunkten überprüft werden. In der Abbildung unten sind die Aufnahmen zweier Kolonien gezeigt. Indem das Wachstum der beiden Kolonien beobachtet und die Aufnahmen bis Tag 0 zurückverfolgt werden, kann bestimmt werden, ob eine Kolonie aus einer oder aus mehreren Zellen hervorgegangen ist. Die Zugabe von Beads (durch die gelben Kreise angezeigt) zum halbfesten Medium dient als eine Referenz für die Position der Kolonie, um zu bestätigen, dass jedes Mal dieselbe Kolonie aufgenommen wurde.
Wachstum von CHO-S-Zellen im halbfesten CloneMedia CHO-Wachstum A Medium. Die Aufnahme von Bildern der 6-Well-Platten zu verschiedenen Zeitpunkten erfolgte mit dem CloneSelect Imager. Es kann eindeutig beobachtet werden, dass an Tag 0 in der oberen Reihe eine einzige Zelle vorhanden ist, während in der unteren Reihe zwei Zellen zu sehen sind. Der gelbe Kreis zeigt die Position eines Beads an, das als Positionsreferenz dient, um zu bestätigen, dass über die Wachstumszeit immer dieselbe Kolonie aufgenommen wurde.
Bereitstellung von Bildnachweisen für die Monoklonalität (Bericht)
Den Bildnachweis für die Monoklonalität innerhalb des Entwicklungsprozesses der Zellline zu erbringen ist nicht so einfach, wie das Bild einer einzelnen Zelle zu exportieren. Zum Beispiel sollten auch hochauflösende Aufnahmen des gesamten Wells überprüft werden, um die Abwesenheit einer zweiten Zelle sicherzustellen.
Mit ein paar einfachen Mausklicks führt die Funktion „Monoclonality Report“ des CloneSelect™ Imager die Erzeugung der Bildnachweise durch, die die Bestätigung der Klonalität unterstützen, und organisiert sie in einem einfach weiterzugebenden Bericht – was Forschern die vielen Arbeitsstunden erspart, die sie für eine eigenhändige Durchführung dieses Prozesses investieren müssten.
Methoden zur Sicherstellung der Monoklonalität
Erfahren Sie mehr über die verschiedenen Methoden zur Verifizierung und Dokumentation der Monoklonalität.