Zellzählsystem
Beim Zellzähler: HUVEC-Zellen
Endothelzellen aus humanen Nabelschnurvenen (HUVEC, human umbilical vein endothelial cells) sind primäre Zellen, die aus der Vene der Nabelschnur isoliert werden. Sie sind ein Modellsystem, das zur Erforschung der endothelialen Zellfunktion in Anwendungsbereichen wie der Hypoxie, Entzündungen, oxidativem Stress, Antworten auf Infektionen und sowohl der normalen als auch tumorassoziierten Angiogenese genutzt wird. Die endotheliale Zellaktivierung, eine entzündliche Antwort, kann durch Zytokine wie TNF-α und IFN-γ ausgelöst werden und führt zur Hochregulierung von Zelladhäsionsmolekülen wie VCAM-1 / CD106. Deren Hochregulierung kann mittels fluoreszent markierter Antikörper und zellulärem Imaging quantifiziert werden.
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Abbildung 1: Zellzahlbestimmungen mit StainFree
HUVEC-Zellen wurden mit dem SpectraMax i3 MiniMax 300 Imaging Cytometer aufgenommen und die Zellen wurden in Durchlichtaufnahmen mit der Analyseeinstellung „CellsB“ identifiziert. Auf der linken Seite sind die original Durchlichtaufnahmen gezeigt. Auf der rechten Seite sind dieselben Bilder mit einer violetten Maske dargestellt, die die von der Software identifizierten Zellen hervorhebt. Gezeigt sind Zellen, die bei hoher (obere Reihe) und geringer (untere Reihe) Zelldichte ausgesät wurden.
Abbildung 2: Bestimmung der Zellzahl mittels StainFree vs. Bestimmung der Anzahl an Zellkernen mittels Fluoreszenz
Bei Dichten von 156 bis 20.000 Zellen pro Well ausgesäte HUVEC-Zellen wurden mit der StainFree Technology (blaue Kreise) ausgezählt oder mit der EarlyTox™ Live Red Dye gefärbt und die rot fluoreszierenden Zellkerne ausgezählt (rote Kreise). Die mit beiden Methoden bestimmten Zellzahlen stimmen über alle Zelldichten hinweg nahezu überein.
Abbildung 3: Zytokin-induzierte VCAM-1- / CD106-Expression in HUVEC-Zellen
Mit den Zytokinen TNF-α und IFN-γ (links) behandelte oder unbehandelte (rechts) HUVEC-Zellen wurden mit FITC-markierten Antikörpern gegen VCAM-1 / CD106 gefärbt und mit dem SpectraMax MiniMax 300 Imaging Cytometer aufgenommen.
Abbildung 4: Inhibition der Zytokin-induzierten VCAM-1- / CD106-Expression in HUVEC-Zellen
HUVEC-Zellen wurden mit 10.000 Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte ausgesät und über Nacht adhärieren und wachsen gelassen. Dann wurden sie für 24 Stunden mit den Zytokinen TNF-α und IFN-γ sowie verschiedenen Konzentrationen des p38-MAP-Kinase-Inhibitors SB202190 behandelt und mit einem FITC-markierten Antikörper gegen VCAM-1 / CD106 gefärbt. Kontrollen ohne Inhibitor und Zytokine wurden mit eingeschlossen.
Tipp:
HUVEC-Zellen zeigen das typische Erscheinungsbild von Kopfsteinpflaster. Für das Auszählen mit StainFree funktioniert die vorkonfigurierte Bildanalyse-Einstellung ‘CellsB’ der SoftMax Pro Software sehr gut. Wenn Zellen ausgezählt werden sollen, deren Morphologie sich aufgrund der Behandlung mit Zytokinen etc. verändert hat, kann die Definition neuer Analyseeinstellungen durch das Zeichnen in den Zellabbildungen hilfreich sein.
HUVEC Cells Analysis Toolkit
- SpectraMax ® i3 Multi-Mode Mikroplatten-Detektionsplattform
- SpectraMax ® MiniMax™ 300 Imaging Cytometer
- SoftMax ® Pro Software
Art der Analyse: Analyse getrennter Objekte
Wellenlänge zum Auffinden von Objekten: TL
Über die Technologie der StainFree-Zellerkennung
Das Imaging zellbasierter Assays benötigt üblicherweise die Verwendung von fluoreszenten Sonden, die für lebende Zellen toxisch sein können oder möglicherweise nur in fixierten Zellen funktionieren. Eine labelfreie Methode zur Analyse von Zellzahl und der Zellkonfluenz ermöglicht es Forschern, die Zellproliferation und Zellgesundheit quantitativ zu überwachen – ohne zeitaufwendige Arbeitsabläufe, die die Zellviabilität beeinträchtigen.
Die SpectraMax i3 Multi-Mode Microplate Platform mit dem MiniMax 300 Imaging Cytometer nutzt die zum Patent angemeldete StainFree-Zellbestimmungs-Technologie. Diese ermöglicht Ihnen, Zellproliferation-, Zytotoxizitäts- und andere Assays ohne Zellkernfärbungen wie DAPI, die sich in die DNA einfügen, oder Lebendzellfärbungen durchzuführen, die langfristig für Zellen toxisch sind.