Was ist Absorption?

Absorption (A), auch als optische Dichte (OD) bezeichnet, ist die Menge an Licht, die von einer Lösung absorbiert wird. Die Transmission ist die Menge an Licht, die durch die Lösung hindurchgeht. Absorption und % Transmission werden oft in der Spektrophotometrie verwendet und können wie folgt ausgedrückt werden:

Absorptionsgleichung

A = Log10 (I0/I)

wobei I0 die Intensität des einfallenden Lichts ist und I die Intensität des Lichts, nachdem es durch die Probe hindurchgewandert ist.

T = I/I0 und %T = 100 (T)

Die Gleichung, die es einem ermöglicht, die Absorption aus der % Transmission zu errechnen ist:

A = 2 - log10 (%T)
 

 

Bestimmung der Konzentrationen mit dem Beer-Lambert-Gesetz

Die Konzentration einer Probe kann aus ihrer Absorption errechnet werden, und zwar mithilfe des Beer-Lambert-Gesetzes, das wie folgt ausgedrückt wird:

A = ε * c * p

wobei ε das molare Absorptionsvermögen, oder molarer Extinktionskoeffizient, in L mol-1 cm-1.
c ist die Konzentration der in der Lösung gelösten Substanz in mol/L.
p ist die Weglänge der Probe, in cm, zum Beispiel 1 cm für eine Küvette.

 

Absorbance-illustration

Ultraviolett (UV)-Messungen wurden in Mikroplatten möglich, als Molecular Devices die ersten UV-kompatiblen Mikroplatten-Reader vorstellte. Seitdem dies ermöglicht wurde, sind die Mikroplatten-Messungen von DNA, RNA und Proteinen sehr beliebt geworden. Erfahren Sie mehr darüber, wie die Absorption gemessen wird, und auch über einige Hauptanwendungen, die mit Absorption arbeiten.

 

  • Wie funktioniert die Detektion der Absorption?

    Wie funktioniert die Detektion der Absorption?

    Spektrophotometer und Absorptions-Platten-Reader messen, wie viel Licht von einer Probe absorbiert wird. Mikroplatten-Reader, die in der Lage sind, das Licht im ultravioletten (UV) Bereich zu detektieren, werden zur Bestimmung der Konzentrationen von Nukleinsäuren (DNA und RNA) oder Proteinen eingesetzt – direkt, ohne dass eine Markierung der Probe notwendig ist. Je nach Material, das gemessen wird, wird Licht einer bestimmten Wellenlänge durch eine Probe geleitet. Ein Detektor auf der anderen Seite der Mikroplatten-Vertiefung misst, wie viel des ursprünglichen Lichts durch die Probe in der Vertiefung absorbiert wurde.

    In was wird die Absorption gemessen?

    In was wird die Absorption gemessen?

    Die Absorption wird mit einem Spektrophotometer oder Mikroplatten-Reader gemessen. Dies ist ein Instrument, das Licht einer bestimmten Wellenlänge durch eine Probe schickt und die Menge an Licht misst, die die Probe absorbiert.

    Spektrophotometer versus Platten-Reader

    Ein Standard-Spektrophotometer misst die Absorption in einer Probe nach der anderen. Üblicherweise ist die Probe in eine Küvette gefüllt, durch die das Licht horizontal geleitet wird. Ein Absorptions-Plattenreader bietet einen höheren Durchsatz und kann die Absorption von Proben in einer Mikroplatte (normalerweise 96 oder sogar 384 Wells) messen, indem er das Licht vertikal durch jede Vertiefung schickt.

    Erfahren Sie mehr über Absorptions-Plattenreader  

  • Wie wird ein Absorptions-ELISA-Protokoll durchgeführt?

    Wie wird ein Absorptions-ELISA-Protokoll durchgeführt?

    Ein ELISA, oder Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ist eine Methode, die für einen quantitativen Nachweis eines Antigens in einer Probe eingesetzt wird. Die meisten ELISAs werden in Mikroplatten durchgeführt, wobei der Boden jeder Mikroplatte als eine feste Oberfläche dient, an die ein Antigen von Interesse bindet – entweder direkt oder über einen Antikörper. Zum Nachweis des Antigens wird ein Enzymkonjugat verwendet, das mit einem Substrat reagiert und eine farbige Lösung erzeugt. Um unspezifisches, ungebundenes Material aus den Vertiefungen herauszuwaschen, wird ein Mikroplatten-Washer verwendet. Die Farbveränderung die entsteht, wenn das Zielantigen anwesend ist, wird mit einem Mikroplatten-Reader detektiert.

    Erfahren Sie mehr über ELISAs  

    Wie beeinflusst Streulicht meine Messung der optischen Dichte (OD)?

    Wie beeinflusst Streulicht meine Messung der optischen Dichte (OD)?

    Streulicht ist ein allgemeiner Begriff für Licht, das unerwünschterweise den Detektor eines Instruments erreicht. Die Auswirkung von Streulicht auf eine Absorptionsmessung ist zumeist eine unerwartet niedrige OD – die gemessene Absorption ist geringer als die tatsächliche Absorption der Probe. Die Auswirkung ist üblicherweise linear und ist dann am größten, wenn ODs über 2,0 bis 2,5 gemessen werden. Streulicht kann durch den Benutzer nicht korrigiert werden und wird üblicherweise auch nicht durch Fehler des Benutzers verursacht. Mögliche Ursachen können optische Komponenten wie gealterte Exzitationsfilter sein. Spektrophotometer und Absorptions-Platten-Reader weisen im Allgemeinen Funktionen auf, um das Streulicht zu minimieren.

  • Zellviabilitäts-, Zellproliferations-, Zytotoxizitäts-Assays (MTT, XTT, MTS)

    Zellviabilitäts-, Zellproliferations-, Zytotoxizitäts-Assays (MTT, XTT, MTS)

    Kolorimetrische Assays, die Tetrazoliumsalze wie MTT, XTT und MTS nutzen, können zur Messung der Zellproliferation und Zytotoxizität eingesetzt werden. Der MTT-Assay baut zum Beispiel auf der Reduktion von MTT durch Enzyme auf, die in lebenden Zellen vorliegen und blaue Formazanprodukte bilden. Diese können durch die Messung der Absorption quantifiziert werden. Die Auswahl eines Assays kann aufgrund des bevorzugten Arbeitsablaufs und der erforderlichen Zeit erfolgen.

    Lesen Sie die Application Note, um etwas über einige dieser Methoden zu erfahren:

    ELISA / Immunoassays (Quantifying antigens, antibodies, cytokines...)

    ELISA / Immunoassays (Quantifizierung von Antigenen, Antikörpern, Zytokinen, usw.)

    Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs) werden dazu verwendet, die Menge eines bestimmten Proteins zu messen, üblicherweise im Mikroplattenformat. Die Ergebnisse werden meistens über Absorption im sichtbaren Wellenlängenbereich ermittelt.

    Hier sind einige Application Notes über ELISAs, die Sie vielleicht interessant finden:

  • DNA-/RNA-Quantifizierung

    DNA-/RNA-Quantifizierung

    Die mit einem Spektrophotometer oder Mikroplatten-Reader bei 260 nm gemessene Absorption einer DNA-Probe kann zur Berechnung ihrer Konzentration verwendet werden. Die Quantifizierung von DNA durch Absorption funktioniert im Mikroplattenformat für Proben im Bereich von ungefähr 0,25 µg/ml bis ungefähr 125 µg/ml.

    Erfahren Sie aus unseren ausgewählten Application Notes, wie die Absorption mit unseren Absorptions-Mikroplatten-Readern gemessen wird:

    Kundenbericht: Absorptions-Platten-Reader für DNA / RNA-Synthetisierer-Tests

    Kundenbericht: Absorptions-Platten-Reader für DNA / RNA-Synthetisierer-Tests

    OligoMaker ApS verwendet den SpectraMax 190 Reader zum Testen von DNA/RNA-Synthetisierern

    „Wir verwenden den SpectraMax 190 als einen wichtigen Schritt beim Testen der von uns konstruierten DNA / RNA-Synthetisierer. Wir müssen die Primer und Proben quantifizieren, um festzustellen, wie viel DNA / RNA mit den DNA- / RNA-Synthetisierern hergestellt wurde.“

    – Karl Ross-Petersen

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  • Endotoxin-Assays

    Endotoxin-Assays

    Die Prüfung auf Kontaminanten ist ein wesentlicher Schritt im Produktionsprozess der pharmazeutischen und Medizinprodukt-Industrie. Eine häufig auftretende Kontaminante, Endotoxin, kann Fieber, Entzündungen, Kopfschmerzen, Übelkeit und sogar den Tod verursachen. Glücklicherweise können Endotoxine mit kolorimetrischen und Turbidimetrie-Assays leicht nachgewiesen werden.

    Diese Application Note beschreibt einen typischen Testaufbau für einen kolorimetrischen Endotoxin-Assay:

    Enzymkinetiken, bakterielles / mikrobielles Wachstum

    Enzymkinetiken, bakterielles / mikrobielles Wachstum

    Viele biologische Experimente benötigen eine Überwachung des Zellwachstums oder eine Messung enzymatischer Veränderungen über längere Zeiträume hinweg (Stunden, Tage oder sogar Wochen). 

    Hier sind ein paar ausgewählte Application Notes, die den Aufbau eines Kinetik-Assays mit unseren Instrumenten und unserer Software illustrieren:

  • Kundenbericht: Absorptions-Platten-Reader in der Biofilm-Forschung

    Kundenbericht: Absorptions-Platten-Reader in der Biofilm-Forschung

    Die Université Catholique de Louvain verwendet unsere SpectraMax Absorptions- und Multi-Mode-Reader, um die Bekämpfung von Biofilmen zu unterstützen

    „Ein weiterer großer Vorteil”, sagt Wafi Siala von der UCL „ist die umfangreiche Auswahl an Mikroplatten-Größen, angefangen bei 6 bis hin zu 384 Wells, die die SpectraMax M-Serie anbietet.“

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    Mikrovolumen-Anwendungen

    Mikrovolumen-Anwendung

    Die Quantifizierung vieler Probentypen wird durch Absorptionsmessungen in einer Küvette oder Mikroplatte durchgeführt. Wenn das Material jedoch knapp ist oder die Proben wertvoll sind, wird die Quantifizierung von sehr kleinen Probenvolumen notwendig. Es sind Instrumente und Zubehör verfügbar, die die Quantifizierung in so kleinen Volumen wie 2 µl oder sogar 0,5 µl ermöglichen.

    Erfahren Sie mehr über unsere Mikrovolumen-Instrumente und -Techniken:

  • Optische Dichte (OD)-Messungen

    Optische Dichte (OD)-Messungen

    UV/VIS-Spektrophotometer und Mikroplatten-Reader unterscheiden sich grundlegend in der Geometrie ihres Strahlengangs. In Spektrophotometern werden die Proben mit einem horizontalen, 1 cm langen Lichtverlauf durch Küvetten oder Röhrchen hindurch gemessen. Dadurch sind Assays, die auf Extinktionskoeffizienten basieren, unkompliziert. In Mikroplatten-Readern resultiert der Lichtstrahl in einem Weg, dessen Länge vom Flüssigkeitsvolumen in jeder Vertiefung abhängig ist. Dieses Problem wurde mit der Molecular Devices PathCheck® Technology beseitigt. Sie korrigiert Messungen der optischen Dichte (OD) automatisch auf eine Weglänge von 1 cm.

    Diese Application Note diskutiert die Prinzipien und die Verwendungsmöglichkeiten der PathCheck Technology:

    Proteinquantifizierung (BCA-, Bradford-, Lowry-Assays)

    Proteinquantifizierung (BCA-, Bradford-, Lowry-Assays)

    Die Proteinkonzentration kann über die Messung der Absorption bei 280 nm in einem UV-Spektrophotometer direkt oder mittels kolorimetrischer Methoden wie BCA oder Bradford Assays indirekt gemessen werden.

    Hier sind einige Application Notes zur Proteinquantifizierung, die Sie vielleicht interessant finden:

Ressourcen zur Absorption

Zugehörige Produkte für die Absorption

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