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ClonePix 2 System

Screening und objektive Auswahl von Säugerzellen mit hohem Durchsatz erreichen

Automatisches Screening von mehr Klonen in kürzerer Zeit als bei konventionellen Verfahren, Selektion von Zellen mit optimalem Expressionsniveau und genaue Aufnahme von Kolonien mit dem ClonePix™ 2 System. ClonePix Systeme werden heute in mehr als 100 Laboren weltweit zur Verbesserung der Produktivität von Arbeitsabläufen eingesetzt, wodurch mehr Zeit zur besseren Beschreibung von Target-Proteinen und zur Durchführung neuer Projekte zur Verfügung steht. Viele Biopharma-Unternehmen haben die ClonePix Systeme in ihre Routinen eingebaut, und die Daten der Systeme werden zunehmend in wissenschaftlichen Publikationen und Konferenzen zitiert.

  • Selektion von Zellen mit optimalem Expressionsniveau mit einheitlicherer Einstufung. Erhöhung der Wahrscheinlichkeit, optimal exprimierende Zellen zu finden und auszuwählen 
  • Verkürzung der Entwicklungszeiten für Zelllinien/Antikörper – Vermeidung von limitierenden Verdünnungsreihen
  • Frühzeitige Ausschließen von gering exprimierenden Zellen auf Basis des Expressionsniveaus in situ
  • Akkurates und sicheres Picken von Kolonien. Reduzierung des Risikos einer Störung von Kolonien mit Robotik-Umgestaltung.
  • Verbesserung der Effizienz von Arbeitsabläufen mit weniger Handhabungsschritten für Platten

Antikörperentwicklung für Biotherapeutika

Optimal sezernierende Zelllinien auswählen

Selektion von Klonen, die optimale monoklonale Antikörper sezernieren

  • Screening von 5463 Kolonien (5 Platten) mit Weißlicht und Fluoreszenz-Imaging
  • Selektion von 16 stark exprimierenden Klonen
  • In CloneMedia-CHO gezüchtete CHO-S-Zellen
  • Screening auf IgG-Absonderung durch Hinzugabe eines CloneDetect-Wirkstoffs
  • Einstufung von Klonen nach Fluoreszenz
    • Benutzerdefinierte Selektionsparameter
  • Genaues Picken von Klonen für Klonexpansion
    • Nähe-Einstellungen verhindern die Aufnahme von Nachbarklonen
    • System überträgt jede Kolonie in ein Well einer Mikroplatte mit 96 Wells 
CHO-S, das humanes IgG exprimiert – ClonePix 2 Koloniepicker-System für Säugetierzellen
CHO-S, das humanes IgG exprimiert: zusammengefügtes Bild
der PetriWell-1-Platte, von welcher an Tag 13 gepickt wurde
Sezernierung von Zelllinien – ClonePix 2 Klon-Screening-System
Graphische Darstellung der Einstufung – Klone nach
Fluoreszenzintensität (Sezernierung) angeordnet

Imaging-Prinzip – Labelfreie Erkennung des sezernierten Antikörpers

Labelfreie Erkennung sezernierter Antikörper – ClonePix 2 Koloniepicker-System für Säugetierzellen

  • Sezernierende Klone, gezüchtet in halbfestem Medium
  • CloneDetect-Wirkstoff hinzugefügt
  • Sezernierte Antikörper bilden fluoreszente Präzipitation

Zelllinienentwicklung für Biotherapeutika

Selektion optimaler Hersteller-NS/0 und CHO-Zelllinien mit dem ClonePix System

  • Screening von mehr Klonen als mit traditionellen Methoden, wodurch die Wahrscheinlichkeit, seltene starke Absonderer zu finden, erhöht wird
  • Automatische Isolierung klonaler Kolonien, wodurch die Notwendigkeit einer limitierenden Verdünnung beseitigt wird
  • In situ-Indikation von Zelllinien mit hohem Titer entfernt unerwünschte Klone aus weiteren Prozessen

FREUNDLICHERWEISE ZUR VERFÜGUNG GESTELLT VON DR. JIANGUO YANG, GROUP LEADER IN CELL LINE DEVELOPMENT, MEDIMMUNE LLC

Verfahren im Vergleich:
 

NS/0 und CHO-Zelllinien – ClonePix Klon-Screening-System

ClonePix System

  • Von der Parentalzelllinie zur Schüttelflasche: 1 Monat
  • 10000 Klone gescreent

Limitierende Verdünnungsreihe

  • Von der Parentalzelllinie zur Schüttelflasche: 2 Monate
  • 1000 Klone gescreent
Klonmethoden im Vergleich:
 

Vergleich von Klonierungsmethoden – ClonePix 2 Koloniepicker-System für Säugetierzellen

ClonePix System

  • 2500 Klone pro Woche
  • 1 Woche Klonen

Limitierende Verdünnungsreihe

  • 300 Klone pro Woche
  • 3 Wochen Klonen

Vergleich der Top-Klone von ClonePix System und limiterender Verdünnungsreihe

Klon Titer (g/l) qP (pcd)  
Klon 1 4,5 54,6 ClonePix System
Klon 2 4,4 44,6
Klon 3 4,3 49,4
Klon 4 4,0 43,8
Klon A 2,9 32,7 Limitierende Verdünnungsreihe
Klon B 2,8 21,0
Klon C 2,7 20,9
Klon D 2,6 29,0
  • Die ausgewählten Zelllinien waren etwa 2 Mal produktiver als die, die mit einem konventionellen Ansatz ausgewählt wurden
  • Subklone vom selben Elternklon (NS/0-Zellen)

Hohe Titer der finalen Klone aus der ClonePix Systemmethode

Klon Titer (g/l)
1 5,8
2 5,3
3 5,7
4 5,8
  • CHO-Zellen – 14-tägiger Prozess mit zugeführten Chargen in Schüttelflaschen
  • Klone mit hohem Titer erhalten (NS/0: 4–5 g/l, CHO: 5–6 g/l), sogar vor Prozessoptimierung
Fazit von MedImmune: „Das ClonePix System ist ein leistungsfähiges Werkzeug bei der Entwicklung von Zelllinien. Diese Methode beschleunigt die Selektion optimal exprimierender Klone und macht sie weniger arbeitsintensiv. Zudem verkürzt sie die Zelllinien-Entwicklungszeit.“

Weitere Informationen:

Schnelle und effiziente Selektion stark produzierender Säugerzelllinien, die therapeutische Proteine/Peptide sezernieren: Application Note herunterladen

Instabile Klone eliminieren

  • Aufzeigen der klonalen Instabilität mit den ClonePix Systemen
  • Erneutes Ausplattieren ausgewählter Klone in halbfestes Medium und innerhalb von 4 bis 7 Tagen erneutes Imaging zur Verifizierung und zum Vergleich der Produktionsraten der Tochter-Klone und/oder erneutes Screening auf Subklone innerhalb von 7 bis 14 Tagen. 

Das Beispiel zeigt Ergebnisse einer Selektion von stabilen Klonen durch Zweitrunden-Screening. Das System überträgt jede Kolonie in ein Well einer Mikroplatte mit 96 Wells.

Selektion stabiler Klone – ClonePix 2 Klon-Screening-System
Oberste 2 % der transfektierten Population
suspensionsadaptierter CHO-Zellen
gemessen an der Produktivität
Instabile Klone eliminieren – ClonePix 2 Koloniepicker-System für Säugetierzellen
Produktivität vs. Fluoreszenz nach dem zweiten
Screeningzyklus Es ist zu beachten, dass Klone
mit hoher Fluoreszenz, aber niedriger Produktivität
(instabil) eliminiert sind

Zellkonfluenz und Zellzahl können vom CloneSelect Imager nachverfolgt werden

Antikörper-Discovery für die Forschung

Hochtiter-Hybridom-Zelllinien zur Antikörperentwicklung identifizieren

  • Parentale Hybridom-Zelllinie wurde erweitert und mit dem ClonePix System gescreent
  • Klone mit hoher Ausbeute wurden mit dem ClonePix System gepickt und mit dem CloneSelect Imager-System auf ihr Wachstum hin überwacht
  • Klone, die die höchsten Wachstumsraten verzeichneten, wurden mit dem Target-Peptidbindungs-Assay auf Antigenspezifität gescreent
  • Hochwertige spezifische Subklone wurden mittels Pilot-Produktion und Aufbau von Zellbanken isoliert
  • Verringerung des Arbeitsablaufs bei der Screeningzeit für Hybridome um >50 %, wobei optimal exprimierende Zellen, die IgG zu höheren Titern sezernieren, gefunden wurden
Titrieren von Hybridoma-Zelllinien – ClonePix 2 Klon-Screening-System
Weißlichtbild
Antikörper-Discovery – ClonePix 2 Koloniepicker-System für Säugetierzellen
Fluoreszenzbild

High-Throughput-Screening Hunderter von Subklon-Kolonien von parentalem Hybridom-Material im ClonePix System unterstützt die Rettung und Stabilisierung einer Hybridom-Zelllinie mit hohen Titern, die hochspezifische monoklonale Antikörper an ein immunogenes virales Antigen sezerniert.

Weitere Informationen

Verbesserte Entwicklung virusspezifischer Hybridome mit den Verfahren von ClonePix und CloneSelect Imager: Application Note herunterladen


Imaging-Prinzip – Labelfreie Erkennung von sezernierten antigenspezifischen mAbsSezernierte antigenspezifische mAbs

  • In halbfestem Medium gezüchtete Hybridom-Klone
  • Complex Initiation Factor (CIF) fängt sezerniertes mAb ein
  • Fluoreszent konjugiertes Antigen zielt auf IgG sezernierende Klone ab

Weitere Informationen

Antigen-spezifische Hybridom- oder B-Zellen screenen und auswählen

Screening antigenspezifischer Hybridome

  • Screening und Selektion antigenspezifischer Klone in situ
  • Für eine breite Palette von Antigenen geeignet
    • – 160 kD multimeres Protein bis 2,6 kD Phosphopeptid
Antigenspezifische Hybridome
Weißlichtbild
FITC-konjugiertes 60-kD-antigenspezifisches IgG – ClonePix 2 System
FITC-konjugierter 60-kD-antigenspezifischer
IgG-produzierender Klon
Screening antigenspezifischer Hybridome
Weißlichtbild
FITC-konjugiertes 60 kD Kontrollprotein
FITC konjugiertes 60 kD Kontrollprotein

Imaging-Prinzip – Labelfreie Erkennung von sezernierten antigenspezifischen mAbsimage_antigen_0.gif

  • In halbfestem Medium gezüchtete Hybridom-Klone
  • Complex Initiation Factor (CIF) fängt sezerniertes mAb ein
  • Fluoreszent konjugiertes Antigen zielt auf IgG sezernierende Klone ab

Weitere Informationen

Proteinexpression und -produktion

Selektion und Entwicklung von GPCR-exprimierenden Zelllinien

Erkennung und Selektion von Zellen, die GPCR auf niedrigem endogenem Niveau exprimieren

  • CloneMedia mit positiven (CHO-M1) und negativen (CHO-K1) Zellen beschichtet und 8 bis 10 Tage lang inkubiert
  • Hinzufügung markierter Antikörper und Zell-Imaging in Hellfeld- und Fluoreszenzkanälen
  • In beiden Kanälen sichtbare Zellen werden aufgenommen und kultiviert
  • GPCR-Expression wird im FLIPR Tetra System durch fluoreszente Calciumsignale validiert
GPCR-exprimierende Zelllinien
Das System lokalisiert und identifiziert
Klone mittels Hellfeld
GPCR-Expression
Im Fluoreszenzkanal werden Zellen mit positiver GPCR-Expression gezeigt

Weitere Informationen

Nach intrinsischer Reporterexpression selektieren

Beispiel: Erkennung intrinsischer GFP-Reporter 

  • Menschliche Brustkrebszellen (MCF-7) mit intern exprimiertem GFP-Fusionsprotein transfektiert
  • Zellen gezüchtet als adhärente Kolonien in MEM Earle’s Flüssigmedium + 10 % FBS
  • Tag 8: Klone mit der höchsten GFP-Expression werden selektiv aufgenommen
Intrinsische Reporterexpression – Weißlicht
Weißlicht
Intrinsischer GFP-Reporter
GFP
Intrinsische Reporterexpression – nach dem automatischen Picken
Nach dem Picken

Nach Zellflächen-Expressionsmarker selektieren

  • Adhärentes CHO K-1 stabil mit P2Y1-Rezeptor transfektiertZellflächen-Expressionsmarker
  • Zellzüchtung in auf CloneMatrix basiertem halbfestem Medium
  • Tag 8: Anti-P2Y1-Rezeptor polyklonal konjugiert mit vom Zerstäuber hinzugefügtem FMAT-Blue
  • Tag 9: Screening und Picken von stark exprimierenden P2Y1-Rezeptor Zellen

Weitere Informationen:

Schnelle automatische Selektion von Säugerzelllinienkolonien nach Proteinexpression an der Zelloberfläche: Application Note herunterladen

Selektion von Sekretoren eines getaggten rekombinanten Proteins

Erkennung von abgesondertem monomerem His/FLAG-markiertem Protein

  • Adhärente CHO-Zellen werden stabil transfiziert
  • Züchtung als suspendierte Kolonien in auf CloneMatrix basiertem halbfestem Medium mit FITC-konjugierten Anti-HIS- und Anti-FLAG-Polyklonalen
  • Starke Sekretoren werden gescreent und an Tag 8 aufgenommen
Markiertes rekombinantes Protein
Weißlichtbild
FITC – Markiertes rekombinantes Protein
FITC-Bild

Imaging-Prinzip

Imaging Prinzip – Markiertes rekombinantes Protein

Screening von Stammzellen/Wartung von Stammzelllinien

Selektierte Kultivierung von Zelllinien anhand von Koloniemorphologie (Weißlicht)

Wartung menschlicher Stammzellen (BG01V hES) mit Weißlicht und Morphologie

  • Züchtung menschlicher Stammzellen (BG01V hES) als Kolonien auf Feederschicht in Flüssigmedium
  • Imaging der Platten und Picken der Kolonien auf Basis von Morphologie
Koloniemorphologie im Weißlicht
Anzeige von Stammzellklonen durch
Weißlicht-Imaging auf dem
ClonePix System
Cloneselect Imager
Typischer aufgenommener Klon,
der auf eine 96-Well-Platte überführt wurde. Imaging
auf dem CloneSelect Imager

Koloniebildung

Zellen werden auf Quellplatten mit halbfestem CloneMedia gezüchtet. Dieser Ansatz erleichter das Plattieren einer großen Anzahl Zellen und gewährleistet die Bildung getrennter Kolonien zur späteren Gewinnung als unabhängige Klone.

Züchtung von Kolonien häufig verwendeter Zelltypen in CloneMedia. Bilderfassung mit CloneSelect Imager

CHO Koloniebildung
Suspensionsadaptierte CHO-Kolonien
in serumfreiem Medium
in CloneMedia-CHO
an Tag 8 nach dem Ausplattieren.
Hybridoma Koloniebildung
Hybridom-Kolonien in
CloneMedia-Hybridom/
Myelom an Tag
8 nach dem Ausplattieren.
HEK293 Koloniebildung
Suspensionsadaptierte HEK293-Kolonien
in serumfreiem Medium
in CloneMedia-HEK
an Tag 13 nach dem Ausplattieren.
 
CHOK1SV Koloniebildung
Suspensionsadaptierte
CHOK1SV-Kolonien in serumfreiem
Medium in CloneMedia-CHOK1SV
an Tag 9 nach dem Ausplattieren.
 

Auswahl von Erkennungsmethoden

Erkennung mit Weißlicht für Imaging und Picken, Fluoreszenz zur Anzeige von Expressionsniveaus

Erkennung von rekombinanten Proteinen und Expressionsmarkern

Rekombinante Proteine und Expressionsmarker
Das Proteinkonstrukt enthält Epitoptag(s),
z. B. His, FLAG® oder Fc, die mit Tag-spezifischen Reagenzien gebunden wurden.

Labelfreie Erkennung antigenspezifischer mAbs aus Hybridomen 

Hybridome antigenspezifische mAbs
Um eine Präzipitation herbeizuführen, werden fluoreszenzkonjugiertes oder getaggtes Antigen plus CIF
(Complex Initiation Factor) verwendet.

Labelfreie Erkennung sezernierter Antikörper 

Nachweis sezernierter Antikörper
Die fluoreszenzkonjugierten CloneDetect-Reagenzien ermöglichen den In-situ-Nachweis
von sezerniertem Maus-, Ratte- oder Human-IgG.
Diese Reagenzien können als Flüssigkeit zugegeben
oder einfach auf die Kolonien gesprüht werden. Dann wird die relative Stärke
der Sezernierung von 1000en Klonen parallel gemessen.

Imaging und Analyse

Die Kolonien werden mit Weißlicht und Fluoreszenz abgebildet und anschließend vom System analysiert.

Kolonien Imaging und Analyse
Im Weißlicht-Imaging
werden die Morphologie,
Größe und Nähe der Klone gemessen
Kolonien Fluoreszenz-Imaging-Analyse
Im Fluoreszenz-Imaging
wird der Expressionsgrad gemessen

Einstufung und Datenanzeige

Einstufung und Datenanzeige – ClonePix 2 System
Graphische Darstellung der Einstufung
  • Einstufung von Klonen nach Fluoreszenz
  • Benutzer definiert Selektionsparameter – System wählt Klone aus
    • Morphometrische Kriterien wie Größe, Rundheit und Nähe im Verhältnis zu Nachbarn
    • Quantitative Kriterien wie Proteinabsonderung oder spezifische Proteinproduktion
  • Quell- und Zielplatten mit Barcode ermöglichen die Nachverfolgung von Daten
  • Bilder aller aufgenommenen Klone vor und nach dem Picken werden zusammen mit ihren Daten gespeichert, einschließlich Picking-Koordinaten

*Download the specifications in our ClonePix 2 brochure here.

*在我们的ClonePix 2手册中下载规格 这里.

CLONEPIX 2 TECHNISCHE SYSTEMDATEN
Imaging 
Software Spezielle Imaging-Software, vorinstalliert auf einem PC für hohe Anforderungen mit Microsoft Windows 7
Weißlicht-Imaging • Trans-Beleuchtung für das Imaging kontrastarmer Kolonien wie adhärente Monolayer oder kleine Kolonien in einer Suspension
• Epi-Beleuchtung für das Imaging von Kolonien während des Pickens
Datennachverfolgung Ein interner Barcode-Reader für Quell- und Zielplatten ermöglicht die Nachverfolgung von Daten bei jedem Durchlauf.
Kamera Integrierte, gekühlte 16-Bit-CCD-Kamera
Imaging-Geschwindigkeit 6-Well-Mikroplatte: 5 Min. bei 2 Wellenlängen (Standardbedingungen)
Auflösung Standard: 28 Mikrometer; Maximum: 1,5 Mikrometer
Instrumente
Sicherheitsumschließung Vollständig geschlossene Arbeitsumgebung mit HEPA-Filtration des Typs 100
Quellplattentyp PetriWell-6-Platte, PetriWell-1-Platte, Greiner 6-Well-Platte, Nunc 6-Well-Platte, Nunc OmniTray
Zielplattentyp PetriWell-96-Platte, Costar 96-Well-Platte, Greiner 96-Well-Platte, Nunc 96-Well-Platte, Falcon 96-Well-Platte
Quellplattenkapazität 10 Platten
Zielplattenkapazität 10 Platten
Kopf für automatisches Picken 8 x Picking-Nadeln – jede Nadel unabhängig gesteuert
Picking-Nadelgröße Der Durchmesser von Picking-Nadeln ist anwendungsabhängig – F1: Suspensionszellen, F2: adhärente Zellen
Automatische Picking-Geschwindigkeit > 200 Klone pro Stunde
Waschbad Ethanol-Waschbad, automatisch neu befüllt
Picking-Systemflüssigkeiten 5 l sterile Wasserversorgung, 5-l-Sammelflasche
Nadeltrocknen Firmeneigene Halogen-Nadeltrockenstation
Instrumentenabmessungen 1010 mm (Breite) x 900 mm (Tiefe) x 1490 mm (Höhe)
Instrumentengewicht 350 kg
Technische Daten der Druckluft
Luft Sauber, ölfrei, mit Submikron-Filtration
Mindestbetriebsdruck 6 Bar (~ 90 PSI)
Mindestbetriebsvolumen 80 l/min
Technische Daten des optionalen Kompressors
Kompressoreinheit Sauberer, ölfreier Kompressor mit Submikron-Filtration
Abmessungen 250 mm (Breite) x 600 mm (Tiefe) x 750 mm (Höhe)
Gewicht 60 kg
Mindestbetriebsdruck 6 Bar
Mindestbetriebsvolumen 80 l/min
Lärmpegel 61 dB(A)
Behördliche Zulassung
Vorschriftenkonformität CE
Qualität Zertifiziert nach ISO9001:2008
Verfügbare Ressourcen
Begleitmaterial Webinare
Veröffentlichungen Produktunterstützung
Verwandte Quellennachweise Bestellung

 

 

 

 

 

 

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  • Verbesserte Hybridom-Entdeckung für die Immundiagnostik mit Verfahren von ClonePix und CloneSelect Imager
  • Identifikation und Selektion von GPCR-Zelllinien mit dem ClonePix 2 System

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Verwandte Quellennachweise

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