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Transfluor-Assay

Erkennt anhand bekannter und/oder Orphan-GPCR-Targets, die Aktivität von Verbindungen in einer High-Content-Screening-Umgebung

Der Transfluor® Assay ist ein zellbasierter Fluoreszenz-Assay für das Screening von GPCR-Liganden und anderer potenzieller Wirkstoffe, die GPCR (G-Protein-gekoppelte Rezeptoren) durch die Deaktivierung oder Desensibilisierung eines gemeinsamen Pathways regulieren. Durch eine fluoreszente Markierung von Beta-Arrestin kann die Position des Rezeptor-Arrestin-Komplexes während der Rezeptoraktivierung überwacht werden. Da die Desensibilisierung nur bei einem aktivierten Rezeptor vorkommt, ist die Detektion der Beta-Arrestin-Translokation und der darauffolgenden Rezeptor-Wiederaufbereitung eine Methode zum Nachweis der Aktivierung jedes GPCR.

Das Studium dieser Mechanismen ermöglicht es Forschern, die Auswirkungen von GPCR-Liganden auf eine Vielzahl physiologischer Prozesse, u. a. Reaktionen in den Bereichen Verhalten, Stimmung, Inflammation, Nervensystem und olfaktorische Reaktion zu identifizieren. Darüber hinaus erhalten die Forscher Einblicke in die Komplexität des Rezeptorabbaus und der Wiederaufbereitung eines bestimmten Targets.

Merkmale

  • Der mit mehr als 100 GPCR validierte Transfluor-Assay funktioniert garantiert mit allen GPCR-Klassen (I, II, III), unabhängig vom interagierenden G-Protein (Gs, Gi/o und Gq/11).
  • Die einzelne Auslesung ist mit allen GPCR-Subtypen kompatibel, u. a. Gi, Gs, Go und Gq, wodurch mehrere GPCR-Assays unnötig werden.
  • Da kein GPCR-Labeling oder bzw. keine GPCR-Markierung verwendet wird, wird vermieden, dass benutzerdefinierte Molekularbiologie die Reaktion Ihrer Targets beeinträchtigt.
  • Das universelle Format erfordert keine Vorkenntnisse zum interagierenden G-Protein, was ein Orphan-GPCR-Screening ermöglicht.
  • Die GFP-basierte Technologie erfordert keine zusätzlichen Substrate, um die Beta-Arrestin-Translokation zu überwachen.
  • Das MetaXpress® Anwendungsmodul automatisiert die Analyse der Beta-Arrestin-Bewegungen zur Zellmembran (Pits) und von endozytischen Vesikeln.
  • Der Liganden-unabhängige Translokations- (LITe™) Assay ist ein Agonisten-unabhängiger Assay, der verwendet wird, um die Translokation von Beta-Arrestin-GFP in Orphan-GPCR zu verifizieren.

Mit der Transfluor-Technologie wird Arrestin-GFP im Zytosol der unstimulierten Zellen dispergiert. Bei der Ligandenbindung mit dem GPCR findet eine schnelle Translokation des Arrestin-GFP vom Zytosol zur Zellmembran und dann in die Clathrin-beschichteten Vertiefungen auf der Membran statt. Der Rezeptor wird dann vor der Aufbereitung von endozytischen Vesikeln aufgenommen und kehrt zur Zellmembran zurück. Vertiefungen und Vesikel können mit handelsüblichen Bildanalyseinstrumenten abgebildet und quantifiziert werden, z. B. mit dem ImageXpress® Micro oder ImageXpress® Ultra System, und bilden die Grundlage für einen universellen High-Throughput High-Content-Assay für alle (bekannten und Orphan-) GPCR.

 

Orphan-GPCR-Assay

 

Im Gegensatz zu aktuellen GPCR-Screeningmethoden basiert die Transfluor-Technologie auf dem Mechanismus zur Beendigung der GPCR-Signale, auch bekannt als Rezeptordesensibilisierung. Dieser Mechanismus ist praktisch allen GPCR gemeinsam und wird durch eine Ligandenbindung aktiviert. Die Transfluor-Technologie erfordert keine Vorkenntnisse zum interagierenden G-Protein. Diese wichtige Funktion der Transfluor-Technologie macht sie ideal für das Screening von Orphan-GPCR (oGPCR).

Eine firmeneigene Methode zur Unterstützung der Validierung von Orphan-GPCR-Screens heißt LITe™ (Liganden-unabhängige Translokation) und ist ein agonistenunabhängier Assay, mit dem die Translokation von Beta-Arrestin-GFP in Orphan-GPCR verifiziert wird.

Ligand-unabhängige Translokation

 

Referenzen zu Transfluor

 

Garippa RJ, Hoffman AF, Gradl G, Kirsch A.
High-throughput confocal microscopy for beta-arrestin-green fluorescent protein translocation G protein-coupled receptor assays using the Evotec Opera.
Methods Enzymol. 2006; 414: 99–120.

Hudson CC, Oakley RH, Sjaastad MD, Loomis CR.
High-content screening of known G protein-coupled receptors by arrestin translocation.
Methods Enzymol. 2006; 414: 63–78.

Oakley RH, Hudson CC, Sjaastad MD, Loomis CR.
The ligand-independent translocation assay: an enabling technology for screening orphan G protein-coupled receptors by arrestin recruitment.
Methods Enzymol. 2006; 414: 50–63.

Haasen D, Wolff M, Valler MJ, Heilker R.
Comparison of G-protein coupled receptor desensitization-related beta-arrestin redistribution using confocal and non-confocal imaging.
Comb Chem High Throughput Screen. Jan. 2006; 9(1): 37–47.

Ghosh RN, DeBiasio R, Hudson CC, Ramer ER, Cowan CL, Oakley RH.
Quantitative cell-based high-content screening for vasopressin receptor agonists using transfluor technology.
J Biomol Screen. Aug. 2005; 10(5): 476–84.

Ozawa K, Hudson CC, Wille KR, Karaki S, Oakley RH.
Development and validation of algorithms for measuring G-protein coupled receptor activation in cells using the LSC-based imaging cytometer platform.
Cytometry A. Mai 2005; 65(1): 69–76.

Oakley RH, Hudson CC, Cruickshank RD, Meyers DM, Payne RE Jr, Rhem SM, Loomis CR.
The cellular distribution of fluorescently labeled arrestins provides a robust, sensitive, and universal assay for screening G protein-coupled receptors.
Assay Drug Dev Technol. Nov. 2002; 1(1 Pt 1): 21–30.

Diese patentierte, von der Duke University lizenzierte Technologie verwendet genmanipulierte Zelllinien, die sowohl das markierte Beta-Arrestin als auch den untersuchten GPCR exprimieren. Diese können verwendet werden, um natürliche oder synthetische Liganden nachzuweisen, u. a. Agonisten und Antagonisten. Der Transfluor-Assay erfordert keine Vorkenntnisse zum interagierenden G-Protein, wodurch er ideal für Orphan-GPCR-Screenings (oGPCR) geeignet ist.

Mit ImageXpress abgebildeter Transfluor-Assay.

Mit Discovery-1 abgebildeter Transfluor-Assay.
Abbildung 1: Beta-2AR-exprimierende Zellen wurden mit Isoprenalin stimuliert. Links: Kontrolle, Mitte: Vertiefungen, Rechts: Vesikel, Oben: Mit ImageXpress abgebildeter Transfluor-Assay, Unten: Mit Discovery-1 abgebildeter Transfluor-Assay.

 

Vertiefungen mit Isoproterenol

Vesikel mit Isoproterenol
Abbildung 2: Die Segmentierung und Analyse wurden mit dem GPCR-Zyklus-Anwendungsmodul für MetaXpress durchgeführt. Ansprechen auf Isoprenalindosis. Oben: Vertiefungen, Unten: Vesikel, Die Fehlerbalken zeigen Standardfehler.

 

Unvollständige GPCR-Liste

 

Die Transfluor-Technologie überwacht die Rezeptoraktivität durch Erkennung der Bewegung von Beta-Arrestin-GFP in der Zelle. Eine unvollständige Liste der GPCR, die eine Translokation von Beta-Arrestin aufweisen, wird unten angezeigt.

Gs

Gi/o

Gq/11

  • A2a-Adenosin
  • A2b-Adenosin
  • Beta-1-Adrenergikum
  • Beta-2-Adrenergikum
  • CRF1 – Kortikotropin-Freisetzungsfaktor
  • D1-Dopamin
  • D5-Dopamin
  • FSH – Follikel-stimulierendes Hormon
  • Glucagon
  • LH – luteinisierendes Hormon
  • PTH1 – Parathormon
  • Prostaglandin E2
  • Prostaglandin E4
  • Sekretin
  • VIP1 – vasoaktives intestinales Peptid
  • V2 – Vasopressin
  • Alpha-2a-Adrenergikum
  • Alpha-2b-Adrenergikum
  • Alpha-2c-Adrenergikum
  • A1-Adenosin
  • A3-Adenosin
  • Apelin
  • C5a-Anaphylatoxin
  • CCR5-Chemokin
  • CXCR1-Chemokin
  • CXCR2-Chemokin
  • CXCR4-Chemokin
  • D2-Dopamin
  • D3-Dopamin
  • D4-Dopamin
  • Edg1 – endothelial diff. Gen
  • Edg2 – endothelial diff. Gen
  • Edg3 – endothelial diff. Gen
  • Edg5 – endothelial diff. Gen
  • 5HT1A-Hydroxytryptamin
  • Delta-Opioid
  • μ-Opioid
  • MCH1 – Melanin-konzentrierendes Hormon
  • M2Ach – muskarinisches Acetylcholin
  • Prostaglandin E3
  • N-Formylpeptid
  • Neuropeptid FF
  • Somatostatin
  • Alpha-1b-Adrenergikum
  • AT1A-Angiotensin II
  • CCK-A-Cholecystokinin
  • CCK-B-Cholecystokinin
  • Cytomegalovirus US28
  • ETA-Endothelin
  • GnRH (Typ2) – Gonadotropin-freisetzendes Hormon
  • 5HT2A-Hydroxytryptamin
  • 5HT2C-Hydroxytryptamin
  • m1ACh – muskarinisches Acetylcholin
  • mGluR1 – metabotropen Glutamatrezeptor
  • NK1-Neurokinin
  • NK3-Neurokinin
  • NT1-Neurotensin
  • Orexin-1
  • Oxytocin
  • PAR2 Proteinase-aktiviert
  • Plättchenaktivierender Faktor
  • TRHR-1-Thyreoliberin
  • TRHR-2-Thyreoliberin

Liste weiterer Rezeptoren

  • 12-Drosophila-GPCR
  • Fz4-Frizzled-Rezeptor
  • TßRIII transformierender Wachstumsfaktor-ß

Der Transfluor-Assay ist mit diesen Systemen kompatibel:

Weitere Informationen finden Sie in der Kompatibilitätstabelle für Assay-Kits und Instrumente.

Für den Kauf dieser Transfluor-Produkte sind die Transfluor-Lizenzvereinbarung und die BioImage-Lizenz erforderlich. Falls Sie eine GFP-Zelllinie oder ein -Plasmid bestellen, benötigen Sie außerdem eine Prolume-Lizenz für den Kauf.

Produktbezeichnung Artikelnummer

Transfluor® Evaluations-Kit (nicht kommerzielle Nutzung)
R8177

Transfluor® Evaluations-Kit (kommerzielle Nutzung)
R8178
U2OS (G418) Ratte-B-Arrestin 2-RrGFP Parentalzelllinien TF-U2OS-rBA2GFP

 

Transfluor Evaluations-Kit

 

Das Transfluor Evaluations-Kit ermöglicht die Verwendung der Technologie für einen einmaligen, auf sechs Monate begrenzten Bewertungszeitraum. Das Kit verfügt über alle notwendigen Werkzeuge für die Bewertung der Technologie mit den eigenen Instrumenten und GPCR des Benutzers. So können sich die Benutzer mit der Technologie vertraut machen, bevor Sie zu einer gestaffelten Lizenz übergehen, die ihre spezifischen Anforderungen erfüllt.

 

Transfluor Evaluations-Kit-Komponenten

 

  • U-2 OS β-Arrestin2-GFP-Zellen (Parentalzelllinie zur Unterstützung der Bestimmung der Transfluor-Reaktion auf den GPCR des Endbenutzers)
  • Transfluor Demo-Platte (Imaging-fähige Platte mit fixierten Zellen, die Sie bei der Instrumentenvalidierung und der Bilderfassung und -analyse unterstützen)
  • Beschränkte Labellizenz
  • Transfluor Evaluations-Kit – Produktbeilage
  • U-2 OS β-Arrestin2-GFP-Zellen – Produktbeilage
  • Transfluor-Schnellstartprotokoll

Transfluor-Benutzerhandbuch (mit Protokollen und Anweisungen für die Fehlerbehebung)

Bitte wenden Sie sich an Ihren Ansprechpartner im Vertrieb, um detaillierte Informationen zu diesem Kit zu erhalten.

Gestaffelte Lizenzoptionen

Für die Nutzung der Transfluor-Technologie ist der Kauf einer Nutzungslizenz für diese Technologie von Molecular Devices erforderlich, die jährlich erneuert werden kann. Eine skalierbare Lizenzstruktur von Forschungsanwendungen bis hin zu High-Throughput-Screening ist verfügbar, z. B.:

  • Lizenz für Transfluor-Assay-Forschung an einem Standort
  • Lizenz für globale Transfluor-Assay-Forschung
  • Lizenz für Transfluor-Screening an einem Standort
  • Lizenz für Transfluor-Assay-Forschung und -Screening an einem Standort

Es sind zwei weitere Drittlizenzen erforderlich, um den Transfluor-Assay auszuführen: Eine GFP-Lizenz (Molecular Devices empfiehlt die Prolume Renilla reniformis (Rr) GFP-Lizenz) und die Fluoreszenzredistributionslizenz von BioImage. Bedingungen:

  • Die Prolume-Lizenz ist jährlich gegen eine Schutzgebühr erneuerbar.
  • Die BioImage-Lizenz erfordert eine einmalige Gebühr.
  • Die Prolume- und BioImage-Lizenzen bieten beide eine weltweite Abdeckung.

Zur Optimierung Ihrer Prozesse können Sie diese Lizenzen direkt von Molecular Devices erwerben. Alternativ können Sie sie auch direkt von Prolume und BioImage erwerben.

Bitte wenden Sie sich an Ihren Ansprechpartner im Vertrieb, um detaillierte Informationen zu diesen Lizenzen zu erhalten. In Verbindung mit der Transfluor-Lizenz bietet Molecular Devices auch eine stabil transfizierte GFP-Beta-Arrestin-Starterzelllinie und relevante Plasmide.