Assays zur Erkennung von Kontaminierungen
Unter dem Markennamen Threshold sind zwei Assay-Kits zum Nachweis von Kontaminanten erhältlich: Threshold® Immunoligand Assay (ILA) und Threshold® Total DNA Assay
Der Threshold Immunoligand Assay misst ein breites Spektrum von Analyten, z. B. Proteine, Peptide, sequenzspezifische DNA und Mikroorganismen für die Entwicklung und Herstellung von Biopharmazeutika. Das Probenspektrum reicht von Fermentationsüberständen, Proben aus einem Reinigungsprozess und anderen biochemischen Präparationen bis hin zu Serum bzw. anderen Körperflüssigkeiten. Die Assays können je nach Größe und Eigenschaften des zu messenden Analyten im Sandwich-Format oder in Form kompetitiver Assays entwickelt werden.
Der Threshold Total DNA-Assay ermöglicht die quantitative Messung von einzelsträngiger DNA im Picogrammbereich. Anders als Hybridisierungstechniken, für die DNA-Proben oder -Primer mit einer spezifischen Nukleinsäure-Sequenz benötigt werden, misst der Threshold Total DNA-Assay DNA mit breiter Sequenzspezifität. Dadurch ist das Threshold System in der Lage, Wirtszellen-DNA sowie andere DNA zu messen, die während des biopharmazeutischen Herstellungsprozesses eingeführt worden sein kann. Da der Assay keine sequenzspezifischen Proben oder Primer erfordert, lässt er sich darüber hinaus leicht bei Proben unterschiedlicher Art anwenden, die aus verschiedenen Wirtsorganismen extrahiert worden sind.
Technologie der Assays zum Nachweis von Kontaminanten
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Threshold® Immunoligand Assay (ILA)
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In the Reaktionsstufe werden die markierten Antikörper, die Probe mit den Analyten, Streptavidin und Anti-Fluoreszein/Urease-Konjugat aus dem ILA-Detektionskit miteinander inkubiert, um einen Reaktionskomplex zu bilden. Da diese Bindung in Lösung stattfindet, bleiben alle Moleküle in ihrer nativen Konformation, sodass eine genaue Messung des Analyten und der 100 % Aktivität der Antikörper gewährleistet ist. Die Bildung des Reaktionskomplexes im Gesamt-DNA-Assay läuft auf ähnliche Weise ab, indem biotinyliertes einzelsträngiges Bindungsprotein und ein an Urease konjugierter Anti-ssDNA-Antikörper ohne Sequenzspezifität an einzelsträngige DNA binden. Alle Assaybestandteile sind im Total DNA Assay-Kit enthalten.
In der Trennungsstufe werden die Reaktionskomplexe aufgrund der starken Affinität von Streptavidin für Biotin auf einer biotinylierten Membran durch einen Filtrationsschritt gebunden und konzentriert. Die Threshold Workstation weist vier 8-Kanal-Filtrationseinheiten auf und bietet die Möglichkeit, zwei weitere Hilfsanschlüsse hinzuzufügen, sodass insgesamt 96 Proben gleichzeitig filtriert werden können.
In der Detektionsstufe wird der auf der Membran gebundene Reaktionskomplex in den Threshold Reader gegeben, der als Substrat Urea und den lichtsteuerbaren potentiometrischen Sensor (LAPS, Light-Addressable Potentiometric Sensor) enthält. In dem Reader wird Urea durch Urease hydrolysiert, wodurch in einem Mikrovolumen von weniger als 1 µl eine Veränderung des pH-Werts herbeigeführt wird. In einer 90-sekündigen kinetischen Messung detektiert der Sensor die Urease-Aktivität von acht verschiedenen Proben gleichzeitig. Die sehr hohe Empfindlichkeit, Präzision und Reproduzierbarkeit des Threshold® Systems sind auf die Kombination des geringen Probenvolumens mit dem rauscharmen Sensor zurückzuführen.
Threshold® Immunoligand Assay (ILA)
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In the Reaktionsstufe werden die markierten Antikörper, die Probe mit den Analyten, Streptavidin und Anti-Fluoreszein/Urease-Konjugat aus dem ILA-Detektionskit miteinander inkubiert, um einen Reaktionskomplex zu bilden. Da diese Bindung in Lösung stattfindet, bleiben alle Moleküle in ihrer nativen Konformation, sodass eine genaue Messung des Analyten und der 100 % Aktivität der Antikörper gewährleistet ist. Die Bildung des Reaktionskomplexes im Gesamt-DNA-Assay läuft auf ähnliche Weise ab, indem biotinyliertes einzelsträngiges Bindungsprotein und ein an Urease konjugierter Anti-ssDNA-Antikörper ohne Sequenzspezifität an einzelsträngige DNA binden. Alle Assaybestandteile sind im Total DNA Assay-Kit enthalten.
In der Trennungsstufe werden die Reaktionskomplexe aufgrund der starken Affinität von Streptavidin für Biotin auf einer biotinylierten Membran durch einen Filtrationsschritt gebunden und konzentriert. Die Threshold Workstation weist vier 8-Kanal-Filtrationseinheiten auf und bietet die Möglichkeit, zwei weitere Hilfsanschlüsse hinzuzufügen, sodass insgesamt 96 Proben gleichzeitig filtriert werden können.
In der Detektionsstufe wird der auf der Membran gebundene Reaktionskomplex in den Threshold Reader gegeben, der als Substrat Urea und den lichtsteuerbaren potentiometrischen Sensor (LAPS, Light-Addressable Potentiometric Sensor) enthält. In dem Reader wird Urea durch Urease hydrolysiert, wodurch in einem Mikrovolumen von weniger als 1 µl eine Veränderung des pH-Werts herbeigeführt wird. In einer 90-sekündigen kinetischen Messung detektiert der Sensor die Urease-Aktivität von acht verschiedenen Proben gleichzeitig. Die sehr hohe Empfindlichkeit, Präzision und Reproduzierbarkeit des Threshold® Systems sind auf die Kombination des geringen Probenvolumens mit dem rauscharmen Sensor zurückzuführen.
Threshold® Total DNA Assay
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In the Reaktionsstufe werden die markierten Antikörper, die Probe mit den Analyten, Streptavidin und Anti-Fluoreszein/Urease-Konjugat aus dem ILA-Detektionskit miteinander inkubiert, um einen Reaktionskomplex zu bilden. Da diese Bindung in Lösung stattfindet, bleiben alle Moleküle in ihrer nativen Konformation, sodass eine genaue Messung des Analyten und der 100 % Aktivität der Antikörper gewährleistet ist. Die Bildung des Reaktionskomplexes im Gesamt-DNA-Assay läuft auf ähnliche Weise ab, indem biotinyliertes einzelsträngiges Bindungsprotein und ein an Urease konjugierter Anti-ssDNA-Antikörper ohne Sequenzspezifität an einzelsträngige DNA binden. Alle Assaybestandteile sind im Total DNA Assay-Kit enthalten.
In der Trennungsstufe werden die Reaktionskomplexe aufgrund der starken Affinität von Streptavidin für Biotin auf einer biotinylierten Membran durch einen Filtrationsschritt gebunden und konzentriert. Die Threshold Workstation weist vier 8-Kanal-Filtrationseinheiten auf und bietet die Möglichkeit, zwei weitere Hilfsanschlüsse hinzuzufügen, sodass insgesamt 96 Proben gleichzeitig filtriert werden können.
In der Detektionsstufe wird der auf der Membran gebundene Reaktionskomplex in den Threshold Reader gegeben, der als Substrat Urea und den lichtsteuerbaren potentiometrischen Sensor (LAPS, Light-Addressable Potentiometric Sensor) enthält. In dem Reader wird Urea durch Urease hydrolysiert, wodurch in einem Mikrovolumen von weniger als 1 µl eine Veränderung des pH-Werts herbeigeführt wird. In einer 90-sekündigen kinetischen Messung detektiert der Sensor die Urease-Aktivität von acht verschiedenen Proben gleichzeitig. Die sehr hohe Empfindlichkeit, Präzision und Reproduzierbarkeit des Threshold® Systems sind auf die Kombination des geringen Probenvolumens mit dem rauscharmen Sensor zurückzuführen.
Threshold® Total DNA Assay
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In the Reaktionsstufe werden die markierten Antikörper, die Probe mit den Analyten, Streptavidin und Anti-Fluoreszein/Urease-Konjugat aus dem ILA-Detektionskit miteinander inkubiert, um einen Reaktionskomplex zu bilden. Da diese Bindung in Lösung stattfindet, bleiben alle Moleküle in ihrer nativen Konformation, sodass eine genaue Messung des Analyten und der 100 % Aktivität der Antikörper gewährleistet ist. Die Bildung des Reaktionskomplexes im Gesamt-DNA-Assay läuft auf ähnliche Weise ab, indem biotinyliertes einzelsträngiges Bindungsprotein und ein an Urease konjugierter Anti-ssDNA-Antikörper ohne Sequenzspezifität an einzelsträngige DNA binden. Alle Assaybestandteile sind im Total DNA Assay-Kit enthalten.
In der Trennungsstufe werden die Reaktionskomplexe aufgrund der starken Affinität von Streptavidin für Biotin auf einer biotinylierten Membran durch einen Filtrationsschritt gebunden und konzentriert. Die Threshold Workstation weist vier 8-Kanal-Filtrationseinheiten auf und bietet die Möglichkeit, zwei weitere Hilfsanschlüsse hinzuzufügen, sodass insgesamt 96 Proben gleichzeitig filtriert werden können.
In der Detektionsstufe wird der auf der Membran gebundene Reaktionskomplex in den Threshold Reader gegeben, der als Substrat Urea und den lichtsteuerbaren potentiometrischen Sensor (LAPS, Light-Addressable Potentiometric Sensor) enthält. In dem Reader wird Urea durch Urease hydrolysiert, wodurch in einem Mikrovolumen von weniger als 1 µl eine Veränderung des pH-Werts herbeigeführt wird. In einer 90-sekündigen kinetischen Messung detektiert der Sensor die Urease-Aktivität von acht verschiedenen Proben gleichzeitig. Die sehr hohe Empfindlichkeit, Präzision und Reproduzierbarkeit des Threshold® Systems sind auf die Kombination des geringen Probenvolumens mit dem rauscharmen Sensor zurückzuführen.
Ressourcen für die Assay-Kits zum Nachweis von Kontaminanten
Application Note
Optimierung der Markierung von Proteinen
Optimizing the labeling of proteins
Der Threshold® Immunoligand Assay (ILA) passt die für ELISA, RIA oder Radiorezeptor-Assays verwendeten Reagenzien an das Threshold System an, indem Biotin oder Fluoreszenzmarkierungen kovalent an …
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Application Note
Quantifizierung der DNA-Restmenge in Biopharmazeutika-Endprodukten mit dem Threshold Total DNA Assay System. Assay-Validierung und Bestimmung der Nachweisgrenze
Quantitation of residual DNA in final product biopharmaceuticals using the Threshold Total DNA assay system. Assay validation and determination of detection limit
Die FDA empfiehlt, dass alle Tests im Rahmen von Qualitätskontrollen, die zur Freigabe biopharmazeutischer Produkte durchgeführt werden, entsprechend der im Code of Federal Regulations Title 21 zusammengefassten …
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Application Note
Eine Methode zur phenolfreien DNA-Extraktion
A phenol-free DNA extraction method
Beurteilung einer DNA-Extraktionsmethode durch die Verwendung eines kommerziell erhältlichen Extraktions-Kits zur Vorbehandlung von biopharmazeutischen Proben, die mit dem Threshold® Total DNA Assay getestet werden sollten. Diese …
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Application Note
Sequenzspezifischer DNA-Assay
Sequence-Specific DNA Assay
Mit dem Threshold® System können Messungen spezifischer DNA-Sequenzen erzielt werden. Biotinylierte und Fluorescein-markierte Oligonukleotidproben, die spezifisch für die zu messende Zielsequenz …
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Application Note
Protein-G-Kontaminant-Assay
Protein G contaminant assay
Protein G ist ein aus der Zellwand von Streptokokken der Gruppe G aufgereinigtes, 30.000–35.000 Dalton großes Protein, das an die Fc-Region von Antikörpern bindet1 . Diese Eigenschaft wird zur Aufreinigung von Antikörpern …
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Application Note
Protein-A-Kontaminant-Assay
Protein A contaminant assay
Protein A ist ein 42.000 Dalton großes Protein, das aus der Zellwand von S. aureus aufgereinigt wird. Es weist vier Bindestellen für die Fc-Region von Antikörpern auf, von denen nur zwei Bindestellen gleichzeitig besetzt …
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Application Note
Kontaminant-Humanes-Transferrin-Assay
Contaminant human transferrin assay
Humanes Transferrin ist ein 80.000 Dalton großes Glykoprotein, das in menschlichem Serum vorkommt und den Transport von Eisen zwischen Zellen ermöglicht. Die eisenfreie Form, Apo-Transferrin, bindet Fe2+ …
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Application Note
Kontaminant-Wirtszellenprotein-Assay
Contaminant host cell-derived protein assay
Polypeptide, die in der Zellkultur oder während der Fermentation von der Wirtszelle gebildet werden („host cell-derived protein” oder „HCP“) und die nicht dem biologischen Produkt von Interesse entsprechen, können …
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Application Note
Kontaminant-BSA-Assay
Contaminant BSA assay
Rinderserumalbumin (BSA, bovine serum albumin), ein 63.000 Dalton großes Protein, ist eine Hauptkomponente von Rinderserum. Fetales BSA-haltiges Kälberserum kann in Kulturmedien für Säugetierzellen, die zur …
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Application Note
Kontaminant-Rindertransferrin-Assay
Contaminant bovine transferrin assay
Rindertransferrin, ein 76.000 Dalton großes Glykoprotein, ist eine der Komponenten von Rinderserum. Das im Serum vorzufindende Transferrin kann Eisenionen gebunden haben. Die mit Eisen gesättigte Form ist …
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Application Note
Kontaminant-Rinder-IgG-Assay
Contaminant bovine IgG assay
Rinder-IgG, ein 160.000 Dalton großes Protein, ist eine der Komponenten von Rinderserum. Fetales Kälberserum, das Rinder-IgG enthält, wird häufig in Kulturmedien für Säugetierzellen eingesetzt, die zur …
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Application Note
Die Anwendung schneller Immunoassays (FAST ILA) in der Zellkultur/Fermentation und der Prozessentwicklung mittels des Threshold Systems
Applications of rapid immunoassays (FAST ILA) in cell culture/fermentation and process development using the Threshold System
Eine präzise Messung der Konzentration biologischer Produkte ist wesentlich bei der Überwachung von Bioreaktoren/Fermentern, der Downstream-Prozessierung und der Qualitätskontrolle von Endprodukten. Derzeit, …
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Application Note
DNAse I-Qualifizierung und Probenbehandlung
DNAse I qualification and sample treatment
Der Threshold Total DNA Assay quantifiziert DNA-Verunreinigungen in biopharmazeutischen Wirkstoffen. DNase I kann zusammen mit dem Total DNA Assay für zwei Zwecke eingesetzt werden: Um das Assay-Signal und …
