Das Visikol-Team entwickelt 3D-Zellkulturmodelle, um den Prozess des Krankheitsfortschreitens bei NASH und NAFLD mithilfe des ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System und der MetaXpress Software zu simulieren
UNTERNEHMEN/UNIVERSITÄT
Visikol, Inc.
TEAM-MITGLIEDER
Megan Casco, Ph.D., Senior Scientist
Tom Villani, Ph.D., Founder and CSO
Peter Worthington, Ph.D., Director of Drug Discovery
Katie Worley, Ph.D., Principal Scientist
VERWENDETE PRODUKTE
ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System
MetaXpress Software zur High-Content-Bilderfassung und -analyse
Die Herausforderung
Für die Erforschung der nichtalkoholischen Steatohepatitis (NASH) und der nichtalkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD) besteht seit jeher ein großer Bedarf an einem In-vitro-Modell, das es den Forschern ermöglicht, auf potentielle Therapeutika mithilfe kostengünstigerer In-Vitro-Assays im Medium-Durchsatz-Format zu screenen. Von Lebererkrankungen sind jährlich Millionen von Menschen in den Vereinigten Staaten betroffen, doch es gibt nur wenige wirksame Therapien. Visikol konzentriert sich darauf, das Analysekonzept für Gewebe und Zellen von einem qualitativen, vom Menschen gesteuerten Ansatz zu einem quantitativen, durch Computer gestützten abbildungsbasierten Ansatz zu verändern. Sie bieten ihren Kunden aus der Pharma- und Biotechnologiebranche Dienstleistungen an, die diese dabei unterstützen, ihre Bestrebungen zur Entdeckung von Wirkstoffen zu beschleunigen sowie die Lücke zwischen In-vitro- und In-vivo-Studien durch den Einsatz fortschrittlicher Zellkulturmodelle und Analysetechniken zu schließen.
Von den frühen Stadien der NASH und der NAFLD ist bekannt, dass diese reversibel sind. Die Forscher haben sich jedoch schwergetan, Behandlungen zur Umkehrung dieses Prozesses zu entwickeln. Eine der Hauptschwierigkeiten bei der Entwicklung solcher Behandlungen besteht darin, dass es bisher keine prädiktiven In-vitro-Modelle gibt, die die Leber und den Krankheitsverlauf der NASH oder der NAFLD in vitro genau wiedergeben. Aufgrund des Fehlens von In-vitro-Modellen sind mehrere klinische Studien in der Spätphase gescheitert – und die Kosten sowie der Zeitaufwand für die Entwicklung dieser Behandlungen waren erheblich.
Darüber hinaus ist das Imaging von 3D-Zellkulturmodellen eine Herausforderung, da biologisches Material das Licht sehr stark streut und die Bildqualität bei dickeren Proben schnell abnimmt. Außerdem kann es bei der Verarbeitung dreidimensionaler Datensätze schwierig sein, eine einheitliche Markierung der 3D-Gewebe zu erzielen.
Die Lösung
Für das Imaging verwendete Visikol das ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System, das es den Forschern ermöglicht, 3D-Zellkulturmodelle – oder Sphäroide – in ihrer Gesamtheit zu visualisieren, wenn diese mit der Visikol® HISTO-M™-Technik aufbereitet wurden. Die MetaXpress® High-Content Image Acquisition and Analysis Software lieferte eine Übersicht für jedes Well der Platte (jedes Well beinhaltet einen Sphäroiden). Das Visikol-Team wählte die richtige Wellenlänge des Lichts aus, um die Fluorophore im Modell anzuregen, die wiederum eine andere Wellenlänge des Lichts emittierten, welches dann von der Kamera des Imager erfasst wurde. Anschließend erfolgte die manuelle Festlegung eines Schwellenwerts, der die Identifizierung positiv gefärbter Kollagenbereiche ermöglichte. Üblicherweise wird das Imaging mit 20 Z-Schnitten durchgeführt, die es der Kamera ermöglichen, den Sphäroid, der im Durchschnitt nur 150 bis 250 Mikrometer dick ist, in seinem gesamten Ausmaß zu erfassen. Die Komprimierung der Z-Schnitte mithilfe der maximalen Emissionsintensität eines jeden Schnitts ermöglichte die Erstellung eines Z-Stapels, der die hellsten Emissionen jedes Schnitts in einem einzigen Bild zusammenfasste. Die daraus resultierenden Abbildungen lieferten Visualisierungen in mehreren Kanälen für Immunmarkierungen, darunter für Albumin, Vimentin, CD68, CD31 und DAPI.
Das Imaging der Modelle ermöglichte den Forschern eine bildliche Darstellung davon, wie Verbindungen mit Zellen interagieren, was wiederum ein Verständnis davon vermittelt, wie eine Verbindung in klinischen Studien auf Menschen wirken könnte. Ein wichtiger Aspekt von NASH-3D-Modellen ist die Analyse von Narbengewebe, das sich im Modell ausbildet. Zudem kann das Imaging auch einen Bezug zwischen der Viabilität der Zellen im Modell und den Wirkstoffen des Kunden sichtbar machen.
MetaXpress Software zur High-Content-Bilderfassung und -analyse
ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System
Verwendete Produkte
Das ImageXpress Micro Confocal System ist eine High-Content-Lösung, die zwischen Weitwinkel- und konfokalem Imaging von fixierten und Lebendzellen wechseln kann. Es kann hochqualitative Aufnahmen von ganzen Organismen, dicken Geweben, 2D- und 3D-Modellen und zellulären oder intrazellulären Ereignissen erfassen. Die Spinning-Disk konfokale und die sCMOS-Kamera ermöglichen das Imaging von schnell ablaufenden und seltenen Ereignissen wie dem Kontrahieren von Herzzellen und der Stammzelldifferenzierung. Mit der MetaXpress Software ermöglicht das System viele konfokale Imaging-Anwendungen, von der Entwicklung von 3D-Assays bis hin zum Screening.
Die Ergebnisse
Um die Krankheitsprogression der NASH und der NAFLD zu simulieren, hat das Team von Visikol mehrere 3D-Zellkulturmodelle entwickelt, die die Mikroumgebung innerhalb des Lebergewebes nachahmen. Diese Modelle werden mithilfe des konfokalen 3D-High-Content-Imaging in Kombination mit anderen Messungen und verschiedenen therapeutischen Behandlungen bewertet, um quantitativ zu beurteilen, inwieweit diese den NASH-assoziierten Fibroseprozess eindämmen.
Eine Co-Kultur aus Visikol HepaRG-Zellen und nicht-parenchymalen 3D-Sphäroiden wurde 1 Stunde lang entweder mit einer Trägersubstanz oder einem ALK-5-Inhibitor vorbehandelt, bevor die Fibrose durch eine 48-stündige Behandlung mit 100 nM TGF-β induziert wurde. In den oben dargestellten Aufnahmen ist DAPI in blau, der Viabilitätsmarker in grün und Gesamt(Pan)-Kollagen in rot dargestellt. Die Quantifizierung der Intensität der Pan-Kollagen-Fluoreszenz und des Volumens wurde für jedes 3D-Zellkulturmodell wie unten beschrieben durchgeführt. Zu erkennen ist, dass TGF-β die Viabilität der Zellen sowie die Größe der Sphäroide verringert und zudem eine Kollagenablagerung auslöst, während der ALK-5-Inhibitor in der Lage ist, sowohl die Verringerung der Zellviabilität als auch die Kollagenablagerung teilweise abzuschwächen.