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Forscher gewinnen mit dem ImageXpress Pico System neue Erkenntnisse über die Immunantwort, die während einer Atemwegsinfektion bei Kindern abläuft

„Das ImageXpress Pico System machte es unserem Team möglich, die Merkmale der Bindung von Mastzellen an RSV-infizierte HLFs präzise und effizient zu untersuchen und ein besseres Verständnis der Entzündungsreaktion gegen RSV zu gewinnen.”

Seattle Children’s Hospital, Seattle Children’s Research Institute, University of Washington, Benaroya Research Institute

Hauptautor: Dr. Stephen R. Reeves, Principal Investigator am Seattle Children’s Research Institute und behandelnder Arzt des Instituts Division of Pulmonary and Sleep Medicine am Seattle Children’s Hospital

ImageXpress Pico automatisiertes Zell-Imaging-System

Die Herausforderung

Die Merkmale der Bindung von Mastzellen und Hyaluronsäure in der extrazellulären Matrix von RSV-infizierten humanen Lungenfibroblasten

Das Respiratorische Synzytial-Virus (RSV) ist eines der Vieren, die Kinder weltweit am häufigsten infizieren. Milde Fälle der Virusinfektion beschränken sich auf eine Entzündung des oberen Atemwegstrakts (Nase und Rachen). Schwerere Fälle breiten sich in den unteren Atemwegstrakt aus (Bronchialröhren und Lunge) und werden von Husten, niedriggradigem Fieber und Appetitsverlust begleitet.

The team

Noch schwerwiegendere RSV-Infektionen können sich zu einer Lungenentzündung, Atemversagen und/oder Tod weiterentwickeln. Das RSV ist hochansteckend und befällt hauptsächlich Kinder. Erwachsene sowie Menschen mit geschwächtem Immunsystem sind jedoch ebenfalls anfällig. Die Symptome und die Ausbreitung des RSV ähneln denen anderer Viren, die die oberen und unteren Atemwege befallen, einschließlich Influenza A und B, Rhinovirus, Adenovirus und dem Coronavirusstamm SARS-CoV-2.

Die zugrundeliegenden Mechanismen dieser Viren besser zu verstehen, könnte über potentielle Behandlungsoptionen Aufschluss geben. Forscher am Seattle Children’s Research Institute, an der University of Washington und dem Benaroya Research Institute haben sich auf den Weg gemacht, diese potentiellen Mechanismen im RSV zu erforschen.

Dr. Stephen Reeves und seine Kollaborationspartner stellten mehrere Experimente auf, um die Downstream-Effekte der Interaktionen zwischen Mastzellen und Hyaluronsäure (HA) in Bezug auf eine Entzündungsreaktion in humanen Lungenfibroblasten (HLFs) zu bestimmen, die mit RSV infiziert waren. Das Imaging von sowohl fixierten als auch lebenden Zellen war erforderlich, um eine Reihe von Bedingungen auszutesten, darunter der Funktionsort und der Funktionsmechanismus von HA innerhalb der extrazellulären Matrix (EZM), die Proteinexpression der Mastzellen und die molekulare Interaktion zwischen HA, Mastzellen und der EZM. Die traditionelle Mikroskopie erforderte die Verwendung von Deckgläsern aus Glas für das Imaging fixierter Zellen, was zu zusätzlichen Arbeitsschritten bei der Gewebeaufbereitung und zusätzlicher Bearbeitungszeit führte. Dr. Reeves und sein Team benötigten ein fortschrittliches System, das qualitativ hochwertige Bilder von sowohl lebenden Zellen als auch fixierten Geweben auf effizientere Art und Weise erfassen kann.

Die Lösung

Hochauflösendes Fluoreszenz-Imaging lebender und fixierter Zellen und Bildanalyse

Das Forschungsteam wählte das ImageXpress® Pico Automated Cell Imaging System wegen seiner Anwenderfreundlichkeit, Flexibilität und robusten analytischen Fähigkeiten.

Assay-Protokolle
Um das Team dabei zu unterstützen, schnell mit seinen Experimenten beginnen zu können, stellten unsere Field Applications Scientists und Technical Support Specialists ein Training vor Ort und Unterstützung für die verschiedenen Assays zur Verfügung. Dies umfasste die Entwicklung von Assay-Protokollen und Sofortanalysen, so dass die Bilder gleichzeitig erfasst und analysiert werden konnten.

Bildaufnahme
Das Forschungsteam führte das Lebendzellen-Imaging durch und fixierte die Gewebe anschließend, um diese auf Komponenten der extrazellulären Matrix zu färben, die mit Lebendzell-Techniken nicht ohne weiteres visualisiert werden können. Das ImageXpress Pico System ermöglichte es dem Team, das gesamte Imaging unter Verwendung von Multi-Well-Platten durchzuführen und die Zeit, die mit der Vorbereitung und Verarbeitung der Proben verknüpft war, signifikant zu verkürzen. Ein Teil der Bildaufnahme bestand darin, große zu untersuchende Bereiche zusammenzufügen, wenn Aufnahmen mit Objektiven mit größerer Vergrößerung durchgeführt wurden. Dadurch wurde die Notwendigkeit beseitigt, zusätzliche Replikate durch traditionelle epifluoreszente Mikroskopie zu untersuchen, und qualitativ hochwertigere Bilder wurden erzielt.

Analyse
Dr. Reeves und seine Kollaborationspartner waren in der Lage, eine quantitative Analyse der Interaktion zwischen Mastzellen (d. h. LUVA-Zellen) und der EZM humaner Lungenfibroblasten (HLFs) durchzuführen, die mit dem Respiratorischen Synzytial-Virus (RSV) infiziert waren. Sehen Sie sich die Abbildungen und Analysedaten unten an.

LUVA cells

Das ImageXpress Pico System wurde ebenfalls eingesetzt, um die Auswirkungen RSV-infizierter HLFs auf die TSG-6-Expression und die Adhäsion von Mastzellen (d. h. LUVA-Zellen) über einen Zeitraum von 48 Stunden zu analysieren. Sehen Sie sich die Abbildungen und Analysedaten unten an. (Hinweis: TSG-6 ist ein Protein, das mit Entzündungsreaktionen in Zusammenhang steht und von dem gezeigt wurde, dass es in RSV-infizierten Zellen hochreguliert ist.)

RSV-Infected Cells

Das Ergebnis

Qualitativ hochwertige Daten ermöglichen wissenschaftliche Durchbrüche zu einem früheren Zeitpunkt

Durch den Einsatz des ImageXpress Pico Systems ist das Team um Dr. Reeves das erste, das demonstriert, dass:

  • in HLFs, die von Spendern gewonnen wurden und mit RSV infiziert sind, eine stärkere HA-Synthese stattfindet, was eine mit HA angereicherte extrazelluläre Matrix (EZM) zur Folge hat
  • eine EZM, die mit HA angereichert ist, eine stärkere Adhäsion von Mastzellen fördert und die Freisetzung von Mastzell-Proteasen verstärkt, die zu einer Entzündungsantwort beitragen (z. B. Atemwegsverengung, Schleimproduktion, Husten)
  • RSV-infizierte HLFs eine verstärkte Expression von Entzündungsmediatoren durch Mastzellen aufweisen sowie eine verstärkte Mastzelladhäsion

Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass die Bildung einer mit HA angereicherten EZM während einer viralen Atemwegsinfektion eine proinflammatorische Umgebung fördert. Dieser Mechanismus könnte weitreichende Konsequenzen für die therapeutische Intervention gegen das RSV und andere Atemwegs-Viren haben.

Infektion von HLFs mit RSV

Zusammenfassung der Ergebnisse: Die Studie demonstrierte, dass die Infektion von HLFs mit RSV die Hochregulierung von Enzymen induziert, die HA synthetisieren (HAS 2 und 3), während Enzyme herunterreguliert werden, die HA abbauen (HYAL 2), was zu einer verstärkten Ansammlung von HA in der EZM und einer stärkeren Adhäsion von Mastzellen führt. Darüber hinaus zeigen RSV-infizierte HLFs eine verstärkte Expression von TSG-6, wodurch die Bindung von Mastzellen an die EZM verstärkt wird. Mastzellen, die an die RSV-induzierte EZM gebunden sind, regulieren die Expression von Mastzell-Proteasen hoch und tragen zur proinflammatorischen Umgebung bei.

Quellenangaben

Finden Sie mehr heraus unter: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6997473/

„Das ImageXpress Pico System entwickelt sich konstant weiter, um unseren sich ständig ändernden Bedarf zu erfüllen und öffnet die Tür für zukünftige Entdeckungen. Wir sind gespannt, was als nächstes kommt!“

Dr. Reeves und andere genannte Autoren sind Teil des Labors von Dr. Jason Debley. Das Debley-Labor wendet epidemiologische, klinische und molekulare Methoden an, um das Fortschreiten von Asthma in der frühen Kindheit zu verstehen und die Rolle des Atemwegsepithels bei Asthma im Kindesalter zu untersuchen.

Forscher am Center for Immunity and Immunotherapies am Seattle Children’s Research Institute erforschen einige der herausforderndsten Erkrankungen von Kindern, die das menschliche Immunsystem beeinträchtigen. Das Ziel ist letztendlich, die therapeutische Kraft der Immunologie zu nutzen, um neuartige Behandlungsmethoden zu entwickeln.