Was ist diskontinuierliche Einzelelektroden-Voltage-Clamp (dSEVC)?
In einer diskontinuierlichen Einzelelektroden-Voltage-Clamp (dSEVC) werden die Aufzeichnung von Spannung und Stromdurchfluss der gleichen Mikropipette zugewiesen. Mit Zeitmultiplexverfahren wird verhindert, dass die zwei Aufgaben interagieren (Abb. 1).
Abbildung 1. Schaltungszeichnung einer diskontinuierlichen Einzelelektroden-Voltage-Clamp.
Eine Einzel-Mikropipette (ME1) dringt in die Zelle ein und die aufgezeichnete Spannung (Vp) wird durch eine einheitlich verstärkte Elektrodenverbindungsbox gestützt (A1). Angenommen, dass Vp exakt gleich dem momentanen Membranpotenzial (Vm) ist. Eine Abtast-Halte-Schaltung (SH1) tastet Vm ab und hält die aufgezeichnete Spannung (Vms) über den Rest des Zyklus aufrecht.
Vms wird mit einer Steuerspannung (Vcmd) in einem Differenzverstärker (A2) verglichen. Die Ausgabe dieses Verstärkers wird zur Eingabe einer geregelten Stromquelle (CCS), falls der Schalter S1 sich in der Stromdurchfluss-Stellung befindet. Die CCS injiziert unabhängig vom Widerstand der Mikropipette einen Strom in diese, der direkt proportional zur Spannung am Eingang der CCS ist. Die Verstärkung dieser Transkonduktanzschaltung ist GƮ.
Die Zeitspanne dieser Stromeinspeisung ist am Beginn des Spannungs-Zeit-Diagramms dargestellt.
Abbildung 2. Spannungs-Zeit-Diagramm zur diskontinuierlichen Einzelelektroden-Voltage-Clamp.
S1 ist in der Stromdurchfluss-Position dargestellt, in der ein Rechteckimpuls in die Mikropipette injiziert wird, der einen Anstieg in Vp bewirkt. Die Höhe des Anstiegs ist durch die parasitäre Kapazität zwischen Glaswand der Mikropipette und Lösung sowie am Eingang des Trennverstärkers begrenzt. Der finale Wert Vp ergibt sich hauptsächlich aus dem IR Spannungsabfall über die Mikropipette, der durch den Stromdurchgang Io durch den Widerstand Rp der Pipette verursacht wird. Nur ein winziger Anteil von Vp ergibt sich aus dem Membranpotenzial (Vm), das an der Spitze aufgezeichnet wird.
S1 schaltet sich dann auf die Position zur Spannungsaufzeichnung um. Wenn der Eingang der CSS 0 Volt beträgt, ist ihr Ausgangsstrom Null und Vp fällt passiv ab. Während der Periode der Spannungsaufzeichnung fällt Vp asymptotisch gegen Vm ab. Damit Vp sich auf ein Millivolt oder weniger an Vm annähern kann, muss ausreichend Zeit gegeben sein. Dies benötigt bis zu neun Zeitkonstanten der Mikropipette (ʈp). Am Ende der Spannungsaufzeichnungs-Periode wird Vm erneut gemessen und der Zyklus beginnt von vorne. Die Ist-Spannung, die zur Aufzeichnung verwendet wird beträgt Vms.
Wie unten im Spannungs-Zeit-Diagramm dargestellt, bewegt sich Vms in kleinen Schritten um den Mittelwert. Die Differenz zwischen Vms(avg) und Vcmd ist die Regelabweichung (Ɛ) an der Patch-Clamp. Diese tritt auf, weil die Verstärkung (GƮ) der CSS endlich ist. Die Abweichung wird zunehmend kleiner, je mehr GƮ zunimmt.
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