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Entwicklung stabiler Zelllinien für die Impfstoffproduktion

Typischer Arbeitsablauf für Zelllinien

Die Entwicklung von Zelllinien ist der Prozess, bei dem eine von einem Klon abstammende Zellpopulation etabliert wird, die genetisch so manipuliert wurde, dass sie über einen stabilen Zeitraum hinweg einen gewünschten Phänotyp (wie die Produktion großer Mengen rekombinanter Proteine) exprimiert. Einzelne Zellen proliferieren, um Kolonien zu bilden, die dann auf die gewünschten Eigenschaften hin untersucht werden können.

Arbeitsablauf zur Entwicklung einer Zelllinie

Schritt 1: Stabile Transfektion

Der Prozess der Entwicklung von Zelllinien beginnt mit dem Einbringen fremder DNA (die für das rekombinante Protein von Interesse kodiert) in eine Wirtszelle. Dieser Prozess wird als Transfektion bezeichnet. Nach der Transfektion beginnen die Zellen damit, das Protein für einen vorübergehenden Zeitraum zu exprimieren (im Allgemeinen weniger als eine Woche), bevor sie die Produktion vollständig einstellen. Eine kleine Subpopulation hält ihre Fähigkeit, das rekombinante Protein zu exprimieren, jedoch über lange Zeiträume hinweg aufrecht, weil sie die fremde DNA in ihr Genom integriert hat. Sie werden als stabil transfizierte Zellen bezeichnet und selektiert, um zum nächsten Schritt überzugehen.

 

Schritt 2: Poolanreicherung

Die Fremd-DNA, die für das Protein von Interesse kodiert, beinhaltet oft zusätzlich einen Selektionsmarker. Dieser kann genutzt werden, um stabil transfizierte Zellen von nicht-transfizierten Zellen zu unterscheiden. Zum Beispiel ist das grün fluoreszierende Protein (GFP) oft mit in die Fremd-DNA eingefügt, so dass die transfizierten Zellen eine Fluoreszenz aufweisen und von den nicht-transfizierten Zellen, die nicht fluoreszieren, unterschieden werden können. Es besteht eine starke Korrelation zwischen den Expressionsniveaus der in der Fremd-DNA anwesenden rekombinanten Proteine und dem Expressionsniveau des GFP-Markers. Dies ermöglicht es Forschern, mithilfe der Fluoreszenzintensität die Zellpools zu identifizieren und anzureichern, die eine starke Proteinexpression aufweisen.
 

Schritt 3: Einzelzellisolierung

Der Prozess einer stabilen Transfektion, egal ob gezielt oder zufällig, erzeugt eine Zellpopulation mit heterogener Proteinexpression. Um sicherzustellen, dass die Zellpopulation genetisch identisch ist, müssen daher einzelne Zellen isoliert und kloniert werden. Dadurch wird die Heterogenität der Expression wesentlich reduziert. Die Einzelzellisolation ist der Prozess, bei dem einzelne lebende Zellen von einem soliden Gewebeblock oder aus einer Zellsuspension für die weitere Analyse voneinander abgesondert werden.
 

Schritt 4: Verifizierung der Monoklonalität und des Zellwachstums

Die Einzelzellklonierung ist ein extrem kritischer Schritt im Prozess der Zelllinienentwicklung. Es ist wichtig, zu verifizieren, dass die einzelnen Zellen in einer Mikroplatte ordentlich voneinander isoliert sind. Dies wird oftmals mithilfe eines Zell-Imagers dokumentiert. Nach dem Klonierungsschritt werden die Zellen üblicherweise auf ihr Wachstum hin überprüft, um sicherzustellen, dass sich ihre Wachstumseigenschaften nicht wesentlich verändert haben. Dies umfasst den Prozess, eine einzelne Zelle bei ihrer Weiterentwicklung in eine Kolonie aus Zellen nachzuverfolgen. 
 

Schritt 5: Screening auf Titer und kritische Qualitätsattribute (CQA)

Dies ist ein Test, mit dem die Menge an rekombinantem Protein oder Antikörpern bestimmt wird, die von einer von einem einzigen Klon abstammenden Zelle produziert wird.
 

 

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