Zellzählsystem
Beim Zellzähler: A431-Zellen
Die Epidermoid-Karzinom-Zelllinie A431 exprimiert abnorm hohe Mengen des Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) und ist ein hilfreiches Modell zur Erforschung der EGFR-vermittelten Signaltransduktion, die in Säugetierzellen das Wachstum, das Überleben, die Proliferation und die Differenzierung reguliert. Aufgrund von Zellen aus der Epidermis einer 85 Jahre alten weiblichen Patientin und von D. J. Giard et al. etabliert, haben A431 Zellen sich als ein wertvolles Modellsystem für die Untersuchung des Zellzyklus, der Apoptose und von Krebs herausgestellt.
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Abbildung 1: Abbildungen, die mit dem SpectraMax MiniMax Cytometer aufgenommen wurden
Die A431-Zellen wurden mit EarlyTox™ Live Red Dye gefärbt und dann mit dem SpectraMax MiniMax Cytometer aufgenommen. Die Identifizierung der Zellen erfolgte mit benutzerdefinierten Einstellungen. Oben: Überlagerte Durchlicht und rot fluoreszierende Abbildungen; Unten: Zellen, die durch eine StainFree-Analyse identifiziert wurden (die violetten Masken zeigen Zellen, die von der Software identifiziert wurden).
Abbildung 2: Zellzahlbestimmung mittels StainFree vs. Zellzahlbestimmung mittels Fluoreszenz
Die A431 wurden bei einer Dichte von 156 bis 20.000 pro Well ausgesät und die Zellkerne wurden mit EarlyTox Live Red Dye gefärbt. Pro Well wurden Bilder an 4 Positionen aufgenommen und in der Mitte des Wells wurde eine Region von Interesse für die Analyse ausgewählt. Anschließend wurde die Zellzahl entweder durch die Anwendung der StainFree-Methode (blauer Graph) oder das Auszählen rot fluoreszierender Nukleine (roter Graph) bestimmt.
Abbildung 3: EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488 Assay
A431-Zellen wurden für 24 Stunden mit seriellen Verdünnungen von Staurosporin (roter Graph), Camptothecin (grüner Graph) und Etoposid (blauer Graph) behandelt und dann mit dem EarlyTox™ Caspase-3/7 NucView 488 Assay Kit auf Apoptose untersucht. Caspase-3/7-exprimierende Zellen wurden grün fluoreszierend gefärbt und mit dem SpectraMax MiniMax Cytometer aufgenommen und ausgezählt. Die Ergebnisse wurden mit der SoftMax® Pro Software graphisch als Anzahl apoptotischer Zellen gegen die Konzentration der Verbindung dargestellt.
Tipp:
A431-Zellen haben eine epitheliale Morphologie und tendieren dazu, Cluster zu bilden. Dies macht es etwas schwierig, sie auszuzählen. Für die Zellzahlbestimmung mit StainFree, gehen Sie in „Neue Einstellungen definieren“ und verwenden Sie das gelbe Zeichenwerkzeug, um den Umriss der Zelle nachzuzeichnen, ohne über den Außenrand der Zelle hinauszugehen. Verwenden Sie das blaue Zeichenwerkzeug, um Bereiche einzuzeichnen, die nicht zu Zellen gehören, ebenso wie Artefakte.
A431 Cells Analysis Toolkit
- SpectraMax ® i3 Multi-Mode Mikroplatten-Detektionsplattform
- SpectraMax ® MiniMax™ 300 Imaging Cytometer
- SoftMax ® Pro Software
Durchlicht (TL, transmitted light)
713 nm (rote Fluoreszenz)
TL-Exposition: 7 ms
Anpassung TL-Fokus: 0 µm
713 Exposition: 12 ms
713 Fokusanpassung: 20 µm
Art der Analyse: Analyse getrennter Objekte
Wellenlänge zum Auffinden von Objekten: TL (StainFree) oder 713 (rote Zellkerne)
TL: Neue Einstellungen definieren (benutzerdefiniert)
713: Größe und Intensität einstellen: Größe = 10 – 30 µm, Intensität über Hintergrund = 70
Über die Technologie der StainFree-Zellerkennung
Das Imaging zellbasierter Assays benötigt üblicherweise die Verwendung von fluoreszenten Sonden, die für lebende Zellen toxisch sein können oder möglicherweise nur in fixierten Zellen funktionieren. Eine labelfreie Methode zur Analyse von Zellzahl und der Zellkonfluenz ermöglicht es Forschern, die Zellproliferation und Zellgesundheit quantitativ zu überwachen – ohne zeitaufwendige Arbeitsabläufe, die die Zellviabilität beeinträchtigen.
Die SpectraMax i3/i3x Multi-Mode Microplate Platform mit dem MiniMax 300 Imaging Cytometer nutzt die zum Patent angemeldete StainFree-Zellerkennungs-Technologie. Diese ermöglicht es Ihnen, Zellproliferation-, Zytotoxizitäts- und andere Assays ohne Zellkernfärbungen wie DAPI, die sich in die DNA einfügen, oder Lebendzellfärbungen durchzuführen, die langfristig für Zellen toxisch sind.